基于文献计量分析的竹组织培养研究进展

李雪梅，吕丹丹，张文根，陈天国，杨光耀

（1.江西省竹子种质资源与利用重点实验室，江西农业大学，江西 南昌330045；2.常州市农业技术推广中心，江苏 常州213000）

竹（Bamboos），一般泛指竹亚科（Bambusoideae）植物，是一类集经济、生态和人文等价值于一体的极其重要的森林资源。全世界竹亚科植物大约1 400余种，其中1 200余种为木本竹（Wood bamboos），180余种为草本竹（Herbal bamboos），主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲的热带、亚热带区域［1－3］。中国是最主要的产竹国，栽培利用历史悠久。据不完全统计，除引种栽培外，中国大约有500余种，绝大多数自然分布于长江流域及其以南各省区，少数种类向北延伸至秦岭、汉水及黄河流域各处［4］。自秦代蒙恬用竹管制笔以后，汉代竹简大兴，东汉蔡伦造纸，宋代毕昇发明印刷术，为竹类资源利用奠定了基础［5］。

多数竹具有较为特殊的开花现象。它们开花周期不定，少则数年，多则几十年，而开花后往往枯死，结实率低，种子获取困难。这些特殊的生物学特性，决定了以种子为主的传统育苗方法对竹类植物的繁育是困难的。目前，其繁育主要以埋鞭、埋秆、埋节等方法为主。然而，以上繁育方式具有母竹利用率低、生态环境破坏大、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等缺点［6－7］。为此，随着20世纪初植物组织培养技术的兴起，为了寻求新的竹苗繁育途径，近20 a来人们开始了大量竹的组织培养研究。

迄今为止，国内外已对牡竹属（Dendrocalamus）、簕竹属（Bambusa）、刚竹属（Phyllostachys）等20余属70多种竹子开展了组织培养研究。其中，麻竹（D.latiflorus）和孝顺竹（B.multiplex）等已有了较为成熟的快繁体系，并应用于工厂化生产。为了增进竹组织培养发展历史的理解，为后续研究提供参考，基于文献情报计量分析和统计学方法对近半个多世纪相关论文的发表量、时间、地区、属种、组培类型以及外植体选择等方面进行了全面深入分析。

1 数据来源和处理方法

1.1 数据来源

以中国知网（CNKI）和Web of Science（WOS）为数据源，对“竹组织培养／竹微型繁殖／Bamboo tissue culture／Bamboo micropropagation／In vitro propagation of bamboo”主题词进行检索，时间跨度为1960－2020年。

1.2 处理方法

利用EndNote、Excel对竹组培文献进行整理、归纳和总结，分别从发文量、国家／地区、属种、外植体、消毒剂、培养基、生长调节剂以及组培竹类型等方面进行深入分析。同时，运用VOSviewer软件绘制与竹组培相关的知识图谱，并对研究机构、作者及竹种进行可视化分析，从而得出该领域作者机构合作影响力及现阶段研究的热点。

2 结果与分析

2.1 总体发文量变化概况

2.1.1 文献数量与年度分布分析 基于主题词检索和甄别筛选，共计获得竹组培研究文献282篇（CNKI中148篇，WOS中134篇）。国外，Alexander和Rao（1968）首次报导毛环竹（Phyllostachys meyeri）成熟种胚离体培养［8］。国内，阙国宁和诸葛强（1991）以芽节为外植体，成功培养出黄竹（Dendrocalamus membranceus）和印度簕竹（Bambusa arundinacea）完整植株［9］。从发文量来看（图1a），以1980年和2015年为临界点，可将竹组织培养研究历史划分为起步、快速增长和衰退3个阶段。其中，CNKI发文增长量明显快于WOS，并于2005年之后实现反超，至2010年后增长趋势有所回落。导致以上差异的原因很多，不同数据库收录的期刊不同，科研评价指标的转变，都有可能导致以上现象的发生。并且，不同国家在不同发展时期对于不同领域的研究重视程度各不相同，研究方向的转变也可能致使发文量下降。

2.1.2 主要国家、机构和作者发文量分析 从发文国家来看（图1b），发展中国家占绝大多数，发文量共计272篇，占97%。而发达国家，如美国、法国和日本，其发文量总计约10篇，不及3%。其中，中国排名第一，发文量占总量的52%（148／282），其次为印度，占40%（114／282），然后是泰国1%（4／282），斯里兰卡1%（4／282），日本1%（3／282），美国1%（2／282）和比利时1%（2／282）等。而从发文机构来看，无论是CNKI还是WOS，竹组培研究力量主要分布于高校，少量分布于研究所。CNKI中，主要研究机构有中国林科院亚热带林业研究所、南京林业大学、云南师范大学、西南林业大学等，主要研究团体核心人物有林新春、谭宏超、岳晋军、丁雨龙、普晓兰、王裕霞、张春霞等（图1c和1d）。WOS中，主要研究机构有Academia Sinica（中央研究院）、TERI（印度能源研究所）、NIFS（斯里兰卡国家基础研究所）、UCR（哥斯达黎加大学）、Toyama Prefectural Univ（日本富山县立大学）、ZAFU（浙江农林大学）、FAFU（福建农林大学）、NJFU（南京林业大学）等，主要研究团体核心人物有Saxen S.、Collins G.B.、Huang L.、Shinjiro O.、Chang W.C.、Sood A.、Chung I.M.、Lin X.C.、Zhang L.等（图1e和1f）。研究作者群体和机构整体上呈现“小聚集、大分散”特征。以上情形可能与竹类植物分布、人口结构和经济、科技发展水平等相关。

2.2 竹子组培族属种研究情况

CNKI库中，竹组培研究涉及168种，合轴型（sympodium）113种，单轴型（monopodium）34种，复轴型（amphipodium）21种（图2a）。WOS中，涉及竹子223种，合轴型190种，单轴型21种，复轴型12种（图2b）。从统计数据可知，合轴型竹种数量远多于单轴型和复轴型的竹种数量，侧面反映目前合轴型竹种的组培技术相比于单轴型和复轴型更为成熟，体系更为完善。

从竹种属级水平来看，不管是CNKI还是WOS，研究主要集中于牡竹属、簕竹属和刚竹属（图2c）。其中，牡竹属约占所有研究属的38%（151／394），如：麻竹（D.latiflorus）、马来甜龙竹（D.asper）、巨龙竹（D.sinicus）、云南甜龙竹（D.brandisii）、版纳甜龙竹（D.hamiltonii）等（图2d和2e）。簕竹属约占30%（118／394），如：孝顺竹（B.multiplex）、绿竹（B.oldhamii）、巴苦竹（B.balcooa）、俯竹（B.tulda）等（图2d和2e）。其中牡竹属和簕竹属组培竹种中，绝大部分竹种均诱导出完整植株且成活率达90%以上。刚竹属约占10%（40／394），如：毛竹（Ph.edulis）、水竹（Ph.heteroclada）等（图2d和2e），仅少数竹种成功诱导出植株，大部分处于诱导出愈伤组织和生根阶段。以上数据表明，牡竹属和簕竹属的组培研究已经形成了良好的态势，在竹亚科中处于较高发展水平和地位。

图2 不同类型的竹子组织培养Fig.2 Tissue culture of different types of bamboo

2.3 外植体的选择分析

具有再生活力的无菌外植体是组织培养成功与否的关键因素之一。竹组织培养所选外植体主要为3类（图3a）：以芽繁芽50%（81／164）、胚培养40%（66／164）和愈伤组织再生植株10%（17／164）。

2.3.1 以芽繁芽 以芽繁芽在竹子品种筛选以及母株特性保持方面优势较为明显，能实现无性系植株的繁殖和利用，常选用幼嫩的腋芽、侧芽和丛芽等。先后以紫竹（Ph.nigra）［10］、马甲竹（B.tulda）［11］、马来簕竹（B.glaucophylla）［12］、麻竹（D.latiflorus）［13］、马来甜龙竹（D.asper）［14］、版纳甜龙竹（D.hamiltonii）［15］、龙竹（D.giganteus）［16］、牡竹（D.strictus）［17］、料慈竹（Neosinocalamus distegia）、五彩香竹（Chimonocalamus songmingensis）、毛环刺竹（B.balcooa）、孝顺竹（B.mutiplex）、佛肚竹（B.ventricosa）［18］、爬竹（Drepanostachyum scandens）［19］等侧芽或幼枝（腋芽）等为外植体，成功实现有效增殖扩繁。

2.3.2 胚培养 胚培养选用种子作为外植体。对墨西哥竹（Otatea aztecorum）［20］、毛竹（Ph.edulis）［21］、马来甜龙竹（D.asper）［22］、福贡龙竹（D.fugongensis）［23］、麻竹（D.latiflorus）、巨龙竹（D.sinicus）［24］、版纳甜龙竹（D.hamiltonii）［25］、马来甜龙竹（D.asper）、小叶龙竹（D.barbatus）、沙罗单竹（Schizostachyum funghomii）、泰竹（Thyrsostachys siamensis）［18］等种胚培养获得愈伤组织，一部分成功诱导生根长成植株。

2.3.3 愈伤组织再生植株 外植体诱导愈伤组织，主要为诱导再生植株和悬浮培养获得单个细胞在培育成植株2个方面。如以金丝慈竹（B.emeiensis‘viridiflavus’）［26］、孝顺竹（B.multiplex）［27］、泰山竹（B.vulgaris‘Striata’）［28］等再生植株为外植体再次成功诱导出新植株。其中通过悬浮培养方式培育新植株的报道较少，如黄竹（D.membranaceus）［29］、孝顺竹（B.multiplex）［30，31］、空竹（Cephalostachyum latifolium）［32］等通过悬浮培养诱导出愈伤组织。

2.4 消毒剂和培养基选择分析

竹组织培养成功与否受消毒剂、培养基和植物生长调节等因素影响。外植体消毒是提高接种成活率的关键，不同植物及不同部位的组织特点不同，所需消毒剂及其浓度也不相同。培养基是植物组织培养的重要基质，含植物生长发育所必需的营养物质。植物生长调节剂是影响植物离体形态发生的最关键因素［33－34］。

2.4.1 消毒剂的选择分析 正确选择消毒剂的浓度和处理时间可以降低污染率，尽量减少组织死亡，提高外植体的存活率。从现有数据来看，消毒剂使用频率排前3的有氯化汞溶液29%（154／521），常用浓度0.05%～6%、乙醇溶液25%（129／521），常用浓度70% ～95%、次氯酸钠溶液23%（120／521），常用浓度0.2%～30%（图3b，表1）。总体上看，此3种消毒剂对大部分外植体具有广适性。此外，还有吐温14%（71／521）、高锰酸钾溶液5%（25／521）以及其他类型的消毒剂4%（22／521），如：Extran碱性溶液［35］、teepol［36］、代森锰锌杀菌剂［37］等。

图3 竹子组织培养外植体、消毒剂、培养基和生长调节剂选择情况Fig.3 Selection of bamboo tissue culture explants，disinfectants，culture media and growth regulators

2.4.2 培养基的选择分析 培养基为植物组织培养提供必要的营养物质和水分等，并且起着保持渗透压、酸碱度平衡的重要作用［38］。竹子组培中，培养基使用频率前3的有MS基本培养基38%（137／364）、3／4MS培养基24%（88／364）、1／2MS培养基19%（70／364）（图3c）。其中，MS培养基无论是诱导、增殖还是生根过程都具有广适性［39－41］，如红哺鸡竹（Ph.iridescens）和白哺鸡竹（Ph.dulcis）在嫩枝条和地下茎培养过程中芽诱导、愈伤诱导和分化诱导过程均使用MS培养基，雷竹（Ph.violascens‘Prevernalis’）侧芽和顶芽诱导、增殖和生根均采用MS培养基［42－43］。并且，MS＋BA（0.2～5.0 mg·L－1）培养基配方在大多诱导过程中具有一定的可适性，如铺地竹（Sasa aegenteastriatus）、曙莉竹（S.versicolo）、人面竹（Ph.aurea）等外植体诱导（表1）。除此之外，还有的使用1／3MS、N6、White、B5、KM-8P、LS等培养基［44－45］。

植物生长调节剂种类和浓度是成功建立组织培养体系的关键［46］。在没有添加植物生长调节剂的培养基中，很少甚至不发生芽增殖，而不同品种和不同基因型对植物生长调节剂的响应不同。竹子组培中，生长调节剂使用前4的分别为BA（占26%，171／672），常用浓度范围0.2～5 mg·L－1；IBA（18%，120／672），常用浓度范围0.01～5 mg·L－1；NAA（17%，114／672），常用浓度范围0.1～5 mg·L－1；KT（17%，112／672），常用浓度范围0.1～2 mg·L－1（图3d，表1）。广泛使用的生长素类有IBA和NAA，细胞分裂素类为BA和KT。其中，BA是最能诱导出丛芽的激素，如毛竹（Ph.edulis）、菲白竹（Pleioblastus fortunei）、花粉麻竹（D.pulverulentusvar.amoenus）等［47－49］。

表1 竹类植株组织培养部分竹种消毒剂和培养基配方Tab.1 The medium formula of some bamboo seeds for tissue culture of bamboo plants

3 讨论与展望

关于竹组培方面的研究综述，前人已有报道，并针对组培中污染、褐化、玻璃化、生长衰退等问题进行了比较深入的讨论［50－53］。研究首次采用文献计量学和统计学手段，基于CNKI和WOS数据库文献，借助VOSviewer、Endnote、Excel等工具，对竹组培相关论文的发表量、时间、地区、属种、组培类型以及外植体选择等方面进行了深入研究。主要发现：①竹组培研究历史与植物组培史大致相符，均经历了从起步到繁盛再产业的发展阶段；②受竹种分布特点、人口结构和经济、科技发展水平等因素影响，竹组培研究主力军主要在发展中国家，特别是印度和中国，研究作者群体和机构呈现“小聚集、大分散”特征；③当前竹组培研究主要集中于牡竹属、簕竹属和刚竹属中，以Dendrocalamus最为突出，合轴型竹种组培相较于单轴型和复轴型更为容易，这与竹种特性、用途和技术水平息息相关；④竹组培外植体主要为3类，即以芽繁芽、胚培养及愈伤组织再生植株，其中以芽繁芽是最主要的繁殖方式；⑤消毒剂主要为氯化汞、乙醇和次氯酸钠等溶液，培养基主要为MS培养基，而生长调节剂一般为BA、IBA、NAA和KT，BA是最能诱导出丛芽的激素，MS＋BA（0.2～5.0 mg·L－1）培养基配方在大多诱导过程中具有一定的可适性。

世界竹资源分布不均，亚太竹区是最主要的竹类植物分布区之一。印度和中国是亚洲最主要的竹资源分布国家，受到高度重视和广泛关注。组培是竹子快繁的一种有效途径，尤其是对于那些开花周期长且实生苗后代分离严重、生长发育优势弱以及经常开花但很难得到可育种子的重要经济竹种。竹种选择相对单一，主要集中于牡竹属、簕竹属和刚竹属。组培成功的竹种，近90%的属于丛生竹，如麻竹（D.latiflorus）、马来甜龙竹（D.asper）、巨龙竹（D.sinicus）等［54］。内在原因或机制尚不清楚。防治污染是竹子组培研究的一大难点。竹类植物拥有特殊的形态结构，表皮细胞外部被密实的乳突和角质层所保卫，乳突外部存在蜡质状物质，乳突中分布着大量的尘埃和菌类孢子，导致难以实现理想的灭菌效果［55］。内生菌比较普遍，如何防治成为组织培养成败的关键。在对外植体进行消毒处理时，必须全面考量取材部位、时间、消毒剂选择、消毒时间等因素。