食品中沙门氏菌能力验证

杜发祥 许菊霞 杜雪琴 缪树婷

摘 要：目的：提升食品检测机构的检测能力，同时结合本次能力验证实验，总结食品中沙门氏菌检测过程中的关键控制要素，寻找操作中的问题，讨论控制措施。方法：依据我国食品药品检验研究院下发的能力验证作业指导书、国家标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》GB 4789.4-2016要求的检验方法对编号为CODE0477、CODE0884、CODE0861的3份巧克力样品中的沙门氏菌进行增菌、分离、生化、血清学鉴定。结果：CODE0477、CODE0884未检出沙门氏菌，CODE0861结果为检出沙门氏菌，3份检测样品的检测结果评价均为满意。结论：通过能力验证实验可提升检验检测水平，同时也为处理细菌性食物中毒原因奠定了基础。

关键词：能力验证;沙门氏菌;食品;鉴定

在我国，细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的，而且大多数来源于动物性食品，沙门氏菌菌型繁多，分布广泛，是重要的人畜共患病原体[1]。据统计，由沙门氏菌引起的食物中毒事件在世界各国的细菌性食物中毒种类中常列榜首[2]。通常沙门氏菌会通过污染食物引起食物中毒事件，人体受感染后在毒素作用下导致胃肠炎、伤寒和副伤寒，平均发病时间为12～24 h，愈后良好。沙门氏菌的传播方式众多，可通过肉、蛋、环境以及无症状带菌者传播，在食品餐饮业加工销售过程中易受到污染，因此能否在食品和食物中毒事故调查中及时成功分离鉴别出该菌极为重要。本实验室结合本次能力验证实验，总结食品中沙门氏菌检测过程中的关键控制要素，讨论控制操作中的问题。

1 材料和方法

1.1 待检样品

沙门氏菌验证实验待检样品为：编号CODE0477、CODE0884、CODE0861的巧克力3份，樣品包装具塞玻璃瓶密封包装，寄送加冰袋，样品接收时包装完好无损坏。

1.2 培养基、试剂和材料

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）、亚硫酸铋（BS）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂与三糖铁（TSI）琼脂采购自广东环凯微生物有限公司;蛋白胨水、靛基质试剂、尿素生化管（pH7.2）、氰化钾 （KCN）生化管和赖氨酸脱羧酶试验生化管采购自北京路桥技术股份有限公司;沙门氏菌多价诊断血清采购于宁波天润生物药业有限公司。无菌锥形瓶、试管等均有本实验室自行消毒后使用;微量移液器吸头、无菌培养皿均为一次性使用材料。

1.3 仪器和设备

生化培养箱（SPX-250-Ⅱ上海跃进医疗器械有限公司）、均质器（BagMixerp?400）、电子天平（AE523C 上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、手提式压力蒸汽灭菌锅（DSX-280KB30 上海申安医疗器械厂）、生物安全柜（HR40-ⅡA2）和显微镜（DSZ200000X 重庆澳浦光电技术有限公司）。

1.4 实验方法

中国食品药品检验研究院能力验证作业指导书、国家标准GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》。

1.4.1 预增菌

按照能力验证作业指导要求，直接取待检巧克力10 g样品，置于盛有90 mL缓冲蛋白胨水（BPW）的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2 min。直接放入培养箱内（36±1） ℃培养18  h。

1.4.2 增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB内，于（42±1）℃培养24 h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC内，于（36±1）℃培养24 h。

1.4.3 分离培养

取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板，（36±1）℃培养48 h;再取一环增菌液，划线接种于一个XLD琼脂平板上，（36±1）℃培养24 h，观察各个平板上生长的菌落特征。

1.4.4 纯培养和生化鉴定

从选择性琼脂平板上分别挑取2个可疑菌落，先做革兰氏染色，然后再接种三糖铁琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于（36±1）℃培养24 h。接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，直接接种蛋白胨水、尿素生化管（pH7.2）、氰化钾（KCN）生化管，挑取的可疑菌落可直接进行沙门氏菌多价诊断血清试探性凝集实验，观察凝集结果。

2 结果与分析

2.1 菌落特征分析

观察表1描述可知，编号为CODE0477、CODE0884的质控样品在BS琼脂菌落为黑色菌落、周边培养基无颜色变化，XLD琼脂平板上都生长有黑色菌落，CODE0861在BS琼脂菌落为中心带光泽的黑色菌落，XLD琼脂上为带金属光泽的黑色菌落，菌落形态都均有沙门氏菌菌落生长特性，由于缺少显色培养基的培养筛选，3份样品中均有可能生长沙门氏菌，需要进一步生化反应鉴别。

2.2 生化鉴定

按照表2生化反应对照发现，三个样品均分解葡萄糖、产气、产硫化氢，赖氨酸脱羧酶试验阳性（+），都为可疑沙门氏菌反应特性。但CODE0477、CODE0884样品呈尿素酶（+），靛基质试验阴性（-），将可疑菌落再次纯化接种，进行尿素酶、氰化钾、赖氨酸脱羧酶试验，仍为尿素阳性（+）、氰化钾阴性（-）、赖氨酸脱羧酶阳性（+），对照国家标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》GB 4789.4-2016标准，认为可疑菌落有可能是沙门氏菌个别变种，需做血清学凝集试验确定。CODE0861样品培养24 h仍然不发酵尿素（-），且氰化钾阴性（-）、赖氨酸脱羧酶阳性（+），靛基质阴性（-）是典型的沙门氏菌的生化反应。

2.3 血清凝集

对3份样品在BS琼脂和XLD琼脂上生长的可疑菌落，先进行沙门氏菌多价试探性血清凝集，结果显示CODE0477、CODE0884不凝集（-），CODE0861凝集（+），将营养琼脂纯化的菌落进行血清学凝集，结果显示CODE0477、CODE0884 不凝集（-），CODE0861凝集（+），通过接种来提高琼脂含量，培养和加热消除Vi抗原等方法，反复凝集试验结果显示CODE0477、CODE0884 仍不凝集（阴性），由于缺乏分型鉴定血清，没有继续对CODE0861进行鉴定分型。综合菌落生长特性、生化反应、血清凝集试验结果分析，最终判定CODE0477、CODE0884样品中为非沙门氏菌，而CODE0861样品中为典型沙门氏菌。

3 讨论

能力验证是有效提升检测能力的途径，也是对实验室环境、操作程序、技术进行质量控制的重要手段。本次能力验证样品是巧克力，目的菌是沙门氏菌，按照国家食品安全标准的相关步骤操作即可，在分离培养时由于缺少沙门氏菌显色平板，不能有效直观挑选可疑菌落，对后期生化反应和血清凝集试验带来一定困难，挑选可疑菌落时应选择具有丰富经验的检验人员进行操作，可先做试探性玻片凝集试验，以增加挑选菌落的准确性，对菌落形态较为典型，但试探性凝集为阴性的菌落应进一步生化鉴定和多价凝集试验，由于H抗原发育不良，造成假阴性的结果。生化鉴定中发现CODE0477、CODE0884两个样品发酵尿素非常迅速，这一特性需在食物中毒事故调查分离病原菌时引起高度重视，因近年来两种及以上病原菌引起的食物中毒案例已有报道，为避免漏诊一定要结合营养琼脂菌落生长情况进行进一步的鉴定分析，通过此次能力验证，在营养琼脂菌液中对这两个迅速发酵尿素的样品进行观察，未发现有“迁徙状生长”现象，可以初步排除变形杆菌的干扰。

参考文献

[1]王军，郑增忍，王晶钰.动物源性食品中沙门氏菌的危险评估[J].中国动物检疫，2007（4）：23-25.

[2]高晗，何娟，严礼.3种沙门氏菌检测方法能力验证[J].食品安全质量检测学报，2017，8（2）：510?515.