LncRNA GAS5通过吸附miR-21促进ADAMTS-1介导的肺成纤维细胞I、Ⅲ型胶原降解

刘理静, 钱 红, 王 乐, 贺兼斌, 胡 柯, 田玉梅

(1. 湖南医药学院护理学院，湖南 怀化 418000; 2. 长沙民政职业技术学院医学院，湖南 长沙 410004;3. 湖南医药学院医学院，4. 湖南医药学院侗医药研究湖南省重点实验室，5. 怀化市第一人民医院呼吸与危重症医学科，湖南 怀化 418000)

肺纤维化以I型胶原(collagen type I，Col Ⅰ)和Ⅲ型胶原(collagen type Ⅲ,Col Ⅲ)在肺间质大量沉积为特征，目前尚无特效治疗方法，给人类健康带来巨大威胁[1]。Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-1(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1motif，ADAMTS-1)是一种新的Zn2+依赖的金属蛋白酶，当分泌到细胞外基质后，可特异性降解Col Ⅰ和Col Ⅲ，发挥抗肺纤维化作用[2-3]。miR-21定位于人17q23.2染色体FRA17B脆性区域，有较强的促纤维化作用[4-6]。本课题组前期研究表明，miR-21通过靶向沉默ADAMTS-1，上调肺成纤维细胞Col Ⅰ和Col Ⅲ表达，加重大鼠肺纤维化[7]。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，在人体内广泛分布。LncRNA可以作为竞争性内源 RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，通过 miRNA 应答元件与靶 mRNA 竞争性结合同种miRNA 分子，抑制 miRNA 对靶 mRNA 的沉默效应，进而上调靶基因表达[8-10]。生长阻滞特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5)是一种全长为630个核苷酸的lncRNA，在人体内定位于非编码蛋白染色体1q25.1的小开放阅读框。研究发现，GAS5以ceRNA方式竞争性地与miR-222 结合，从而抑制肝纤维化形成[11]，但其在肺纤维化中的作用仍不清楚。我们通过生物信息学分析发现，GAS5与ADAMTS-1具有相同的miR-21结合位点，表明三者之间存在ceRNA调控作用的生物学基础。为此，本研究以人胚肺成纤维细胞MRC-5为研究对象，探讨GAS5对Col Ⅰ、Col Ⅲ表达的影响及机制，从而为肺纤维化防治提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂MRC-5细胞、HEK293T细胞由中国科学院上海细胞库提供；GAS5慢病毒过表达载体(LV-GAS5)和空载体(LV-NC)购于上海闪晶分子生物科技有限公司；miR-21 模拟物(mimic)及相应的阴性对照物(Mimic-NC)由广州锐博公司合成；ADAMTS-1 siRNA、scrambled siRNA及荧光实时定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)引物由上海生工生物工程公司合成；胎牛血清(10099141)和RPMI 1640培养基(C11875500BT)购于Gibco公司；脂质体3000转染试剂(lipofectamineTM3000， L3000015)、TRIzol试剂(15596026)和PVDF膜(T2234)由美国Invitrogen公司提供；逆转录试剂盒(A5001)、pGL3载体(E1751)购自美国Promega公司；SYBR Green Real Time PCR Master Mix(QPK-201)为日本 Toyobo公司产品；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)、RIPA 裂解液(R0010)分别购于上海碧云天生物技术有限公司、北京索莱宝科技有限公司；兔抗人ColⅠ(sc-59772)、Col Ⅲ(sc-514601)、ADAMTS-1(sc-47727)、β-actin(sc-47778)单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG(sc-2004)由美国Santa Cruz 公司提供。

1.2 细胞培养与处理复苏MRC-5细胞，接种于含100 g·L-1胎牛血清的RPMI 1640培养基中，并置入37 ℃、50 g·L-1CO2、80% ～ 90%湿度的培养箱进行培养。次日更换培养液，待细胞生长至80%～90%融合度时，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶，消化细胞，进行传代培养。

取处于对数生长期的MRC-5细胞，以1×106个/孔接种于24孔板中，加入0.18 mL RPMI 1640培养液，继续培养24 h，当细胞融合度达到85%时，随机将细胞分为3组：对照组、LV-NC组、LV-GAS5组，分别用培养液、LV-NC、LV-GAS5处理细胞48 h。为了探讨miR-21/ADAMTS-1途径在GAS5调控Col Ⅰ和Col Ⅲ表达中的作用，先用miR-21 mimic或ADAMTS-1 siRNA转染MRC-5细胞48 h，再LV-GAS5感染细胞相同时间。

1.3 生物信息学预测利用lnCeDB(http：//gyanxet-beta.com/lncedb/)、Targetscan(http：//www.targetscan. org/)、 PicTar(http：//www.pictar.org/)等在线软件预测GAS5、miR-21、ADAMTS-1 3′-非翻译区(3′-untranslated region, 3′-UTR)之间的靶向结合情况。

1.4 荧光素酶活性检测根据Genebank收录的GAS5基因序列，利用引物分析软件Primer Premier 5.0设计针对GAS5的引物，以MRC-5细胞基因组DNA为模板行PCR扩增，将扩增产物插入荧光素酶报告载体pGL3，构建野生型GAS5载体(GAS5-WT)，同时对与miR-21结合的GAS5中MRE序列进行CTGGA到CCTTA的点突变，构建突变载体，用lipofectamineTM3000，将上述质粒与miR-21 mimic或mimic-NC 共转染HEK293T细胞48 h，双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性。

1.5 qRT-PCR检测GAS5、miR-21、ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ表达收集处理完毕后的MRC-5细胞，TRIzol试剂提取总RNA，利用逆转录试剂盒，将RNA逆转录成cDNA。miR-21引物序列：上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游5′-GCCGCTAGC TTATCAGACTGATGT-3′；U6引物序列：上游5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′；GAS5引物序列：上游5′-CTTCTGG GCTCAAGTGATCCT-3′，下游5′-TTGTGCCATGAGA CTCCATCAG-3′；ADAMTS-1引物序列：上游5′-GT TTGTGGAGGAAATGGCTCCA-3′，下游5′-CACTTC AATGTTGGTGGCTCC-3′；ColⅠ引物序列：上游5′-CTCTTGCTGCTGCTCCCTAC-3′，下游5′-CCACCC CAGGGATAAAAACTGC-3′；ColⅢ引物序列：上游5′-GAATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3′，下游5′-GCTG TTTTTGCAGTGGTATGTAATG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-TGGGTGTGACCATGAGAAGT-3′，下游5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。在Roche 480荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s，62 ℃复性20 s，72 ℃延伸30 s，总共45个循环。用ΔΔCt值法，以U6为内参照定量miR-21表达，同时用GAPDH为内参照定量GAS5、ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ表达。

1.6 Western blot检测ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ表达利用RIPA裂解液提取MRC-5细胞总蛋白，BCA法测定蛋白样品浓度，然后上样、电泳及转PVDF膜，分别加入兔抗人ADAMTS-1(1 ∶ 500)、Col Ⅰ(1 ∶ 500)、Col Ⅲ(1 ∶ 500)、β-actin(1 ∶ 2 500)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤PVDF膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶ 2 500)二抗，在37 ℃条件下孵育1 h，ECL显色，暗室曝光、拍照。利用Labwork凝胶图像分析系统对所有胶片进行扫描，以β-actin为内参照定量目的蛋白表达。

2 结果

2.1 LV-GAS5感染MRC-5细胞效率检测用LV-GAS5、LV-NC分别处理MRC-5细胞48 h，qRT-PCR检测GAS5表达，结果显示(Fig 1)，LV-GAS5组GAS5水平较对照组增加(P<0.01)，但LV-NC组与对照比较，差异无显著性(P>0.05)，提示LV-GAS5感染MRC-5细胞具有较高的效率。

Fig 1 Comparison of GAS5 expression in MRC-5 cells

2.2 GAS5下调MRC-5细胞Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白表达在LV-GAS5感染MRC-5细胞48 h后，qRT-PCR、Western blot检测Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA与蛋白表达水平。如Fig 2所示，过表达GAS5明显减少Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白水平(P<0.01)，但对其mRNA水平无影响(P>0.05)，表明GAS5在转录后水平调控Col Ⅰ、Col Ⅲ表达。

Fig 2 Effects of GAS5 on Col Ⅰ and Col Ⅲ mRNA (A) andprotein(B) expression in MRC-5

2.3 证实GAS5、miR-21、ADAMTS-1之间存在ceRNA调控网络作用生物信息学预测发现(Fig 3)，GAS5与ADAMTS-1分享一个相同的miR-21 结合位点(GACC，即红色框与蓝色框重叠的部分)。而且，荧光素酶报告基因显示(Fig 4)，miR-21 mimic减少野生型GAS5荧光素酶活性(P<0.01)，但对其突变型荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)，进一步提示GAS5能够与miR-21靶向结合。结合我们前期研究已经鉴定ADAMTS-1为miR-21的靶基因，可确定GAS5、miR-21、ADAMTS-1之间存在ceRNA作用模式。

Fig 3 Binding sites among GAS5, ADAMTS-1 andmiR-21 predicted by bioinformatics

Fig 4 Comparison of luciferase activity among

2.4 GAS5上调ADAMTS-1表达利用LV-GAS5孵育MRC-5细胞48 h，qRT-PCR、Western blot检测ADAMTS-1表达，发现过表达GAS5明显增加ADAMTS-1 mRNA与蛋白水平(P<0.01)，见Fig 5。

2.5 ADAMTS-1介导GAS5对Col Ⅰ、Col Ⅲ表达的抑制作用ADAMTS-1是降解Col Ⅰ、Col Ⅲ的关键酶，为了阐明GAS5是否通过ADAMTS-1下调Col Ⅰ、Col Ⅲ表达，首先用ADAMTS-1 siRNA或scrambled siRNA转染MRC-5细胞48 h，Western blot结果显示(Fig 6)，相对于对照组，ADAMTS-1 siRNA组ADAMTS-1蛋白水平减少了约83%(P<0.01)，表明合成的siRNA能有效沉默内源性ADAMTS-1表达。然后以ADAMTS-1 siRNA 转染MRC-5细胞48 h，再用LV-GAS5处理细胞相同时间，发现ADAMTS-1 siRNA预处理后加入LV-GAS5，Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白水平较LV-GAS5组升高(P<0.01)，与对照组相近，见Fig 7，表明GAS5通过上调ADAMTS-1表达，促进Col Ⅰ、Col Ⅲ降解。

2.6 GAS5下调miR-21表达在LV-GAS5孵育MRC-5细胞48 h后，通过qRT-PCR检测miR-21表达情况，结果显示(Fig 8)，相对于对照组，LV-GAS5组miR-21表达水平明显降低，差异有显著性(P<0.01)。

Fig 5 Effects of GAS5 on ADAMTS-1 mRNA (A) and protein(B) expression in MRC-5

Fig 6 Comparison of ADAMTS-1 protein expression in MRC-5

2.7 GAS5通过吸附miR-21调控ADAMTS-1、Col Ⅰ、Col Ⅲ表达为了揭示miR-21在GAS5下调Col Ⅰ、Col Ⅲ表达中的作用，先用miR-21 mimic转染MRC-5细胞48 h，再用LV-GAS5处理细胞相同时间，qRT-PCR、Western blot检测ADAMTS-1、Col Ⅰ、Col Ⅲ表达。如Fig 9所示，LV-GAS5单独处理上调ADAMTS-1 mRNA与蛋白表达(P<0.01)，下调Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白表达(P<0.01)，然而这些作用被miR-21 mimic预处理逆转(P<0.01)，提示GAS5通过吸附miR-21，上调ADAMTS-1表达，进而促进Col Ⅰ、Col Ⅲ降解。

Fig 7 Effects of LV-GAS5 combined with ADAMTS-1 siRNAon Col Ⅰ and Col Ⅲ mRNA (A) and protein (B) expression

Fig 8 Effects of GAS5 on miR-21 expression

Fig 9 Effects of LV-GAS5 combined with miR-21 mimicon mRNA (A) and protein (B) expression of ADAMTS-1, Col Ⅰ and Col Ⅲ in MRC-5

3 讨论

肺纤维化是一种难治性的呼吸系统疾病。Col Ⅰ和Col Ⅲ是细胞外基质的主要成分，在生理情况下，它们的合成代谢与分解代谢处于动态平衡之中，从而维持肺组织的正常结构与呼吸功能。然而，在病理情况下，肺成纤维细胞处于活化状态，大量产生Col Ⅰ和Col Ⅲ，并在肺间质中大量沉积，这是肺纤维化形成过程中最重要的病理特征。因此，寻找调控胶原合成与分解代谢的潜在机制对于肺纤维化的防治具有十分重要的意义。GAS5是一种多效性的lncRNA，参与调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移、分化等多种生物学过程，与肿瘤的发生发展密切相关[12]。近年研究发现，GAS5也具有抗多种器官纤维化作用[13]，但在肺纤维化中的作用尚未阐明。本研究发现，过表达GAS5降低MRC-5细胞Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白水平，但对其mRNA水平无明显影响，表明这种lncRNA可促进Col Ⅰ和Col Ⅲ分解代谢，可能是一个新的抗肺纤维化因子。

Salmena等[14]在2011年首次提出ceRNA概念，指具有相同miRNA 应答元件的mRNA、假基因转录物、lncRNA等通过竞争性结合同种miRNA来调控各自的表达水平，从而影响细胞的功能。ceRNA是广泛存在于动物体内的一种全新的基因表达调控模式，已被证实参与肺纤维化等多种疾病的发生发展过程[15]。本研究结果表明，GAS5与ADAMTS-1具有共同的miR-21 结合位点，而且miR-21 mimic减少野生型GAS5荧光素酶活性，但不影响其突变型荧光素酶活性，从而证实GAS5为miR-21的靶基因。同时，我们的前期研究已经鉴定ADAMTS-1为miR-21的靶基因[7]。因此，GAS5、miR-21、ADAMTS-1之间存在ceRNA作用模式，这为探讨GAS5促Col Ⅰ和Col Ⅲ降解机制提供了切入点。

ADAMTS-1是ADAMTS家族中第一个被发现的成员，属于分泌型蛋白，分泌后经含 TSP-1 的血小板反应素同源域锚定于细胞外基质，通过金属蛋白酶结构域分解Col Ⅰ和Col Ⅲ 等细胞外基质成分[16]。研究表明，在博来霉素所致的小鼠肺纤维化模型中，miR-21过表达明显降低ADAMTS-1水平，导致肺组织Col Ⅰ和Col Ⅲ含量增加和肺纤维化加重[17]。我们体外研究也发现，miR-21通过靶向沉默ADAMTS-1促进肺成纤维细胞Col Ⅰ和Col Ⅲ产生[7]。本研究中，过表达GAS5降低miR-21水平，上调ADAMTS-1表达，并且miR-21 mimic或ADAMTS-1 siRNA预处理阻断了过表达GAS5对Col Ⅰ、Col Ⅲ降解的促进作用，提示miR-21/ADAMTS-1信号通路可能是GAS5促进MRC-5细胞Col Ⅰ、Col Ⅲ降解的关键途径。

总之，本研究结果表明，GAS5以 ceRNA方式竞争性结合miR-21，使ADAMTS-1表达上调，进而促进Col Ⅰ、Col Ⅲ等细胞外基质成分降解，为进一步揭示GAS5在肺纤维化发生发展中的作用奠定了基础，靶向调控GAS5表达可能是肺纤维化防治的新途径。

(致谢：本实验在侗医药研究湖南省重点实验室和怀化市第一人民医院医学中心实验室完成，感谢各位老师的指导和帮助。)