PLA/PGA复合纳米纤维膜的制备及其生物相容性与降解性研究

2020-10-28王诗卉金俊弘杨胜林

合成纤维工业 2020年5期

王诗卉，李光，金俊弘，杨胜林

(东华大学材料科学与工程学院纤维材料改性国家重点实验室，上海 201620)

疝气是普外科的一种常见病和多发病[1]，其传统的治疗方法是对薄弱组织进行缝合、加固软组织，但术后复发率高，目前较好的方式是使用医疗补片修补软组织薄弱部位，降低了复发率和手术疼痛感，伤口小，恢复快[2]。此外，据统计7%的女性会出现盆底功能障碍—盆底脱垂，并需要治疗以缓解症状，其中在5年内需要重复治疗的患者占13%[3]。目前，治疗女性盆底功能障碍性疾病的先进手段是在体内植入补片以起到支撑修复重建盆底功能的效果，相比传统切除的方式，植入补片治疗可以提高手术安全性，改善术后患者的生活质量[4]。无张力疝气修补术和盆底重建的关键均在于选择合适的补片材料，要求补片材料既具有足够的力学性能以达到修补效果，又具有可降解、生物友好特性以减少受体排异反应。

目前应用最广泛的医用补片材料是聚丙烯[5]。聚丙烯补片的特点是具有较好的强度以及弹性，但是作为一种不可吸收的材料，植入体内后，会引起较强的炎症反应[6]。因此，可吸收补片及其材料成为人们研究的热点。聚乳酸(PLA)及聚羟基乙酸(PGA)均是生物友好可降解材料，其在体内最终降解产物是水和二氧化碳，在医学上已得到广泛应用，是目前发展前景较好的生物医用材料。其中，PLA力学性能良好，但其降解速度较慢，降解产物二氧化碳会使组织周围酸性增加引起组织非炎症反应，且易析出小PLA结晶影响细胞生长的活性和增殖[7]。PGA与PLA相比降解速度快、生物相容性好，在体内应用时有利于细胞增殖以及细胞粘附[8]，但其力学性能衰减较快。20世纪90年代初，研究人员开发了由丙交酯(LA)和乙交酯(GA)开环聚合得到的高相对分子质量PLA和PGA，但由于其对水和热的敏感性而未能引起广泛重视。A.M.REED等[9]将GA和LA共聚，发现通过改变GA和LA的比例，可以有效调节共聚物的降解速率。对于生物可降解材料，材料的降解速度是否与应用所需时间匹配是一个重要因素。PGA、PLA及其共聚物(PLGA)(乙交酯-丙交酯按不同比例共聚所得的聚合物)目前较常用于组织工程和支架材料。PGA和PLA具有各自的优缺点，将其复合(共聚或共混)使用，可以根据不同的复合比例来调节材料的降解速率和力学性能，获得降解速度与组织修复速度相一致的材料，并且不会由于降解而失去所需强度，作为补片用于治疗时可以修复组织，且逐渐降解，最终完成生物意义上的修复。

OUYANG H W等[10]使用PLGA制作肌腱支架，以人骨髓间充质干细胞(BMSC)为接种细胞植入兔子体内，12周后检测，PLGA支架拉伸刚度可达正常功能的87%，说明PLGA作为生物材料使用，可满足材料所需力学性能且生物相容性良好。寇士军等[11]将PLA、PGA熔融纺丝，得到一种新型芯鞘复合纤维，并对其降解性能进行研究，结果显示，复合纤维的水解率随着PGA含量的增加而增加，证明了可通过调整PLA与PGA的复合比例来控制复合纤维的降解速率的可行性。战鹤楠等[12]将聚己内酯(PCL)与γ-聚谷氨酸(γ-PGA)混合，利用静电纺丝制得复合纤维膜，成膜性良好，且纤维的形貌均一，作为补片材料使用时形貌良好。

综上所述，合理匹配利用PLA良好的力学性能和PGA良好的生物相容性能，制备的PLA/PGA复合材料可单独使用或作为辅材，有望在医用补片开发方面获得利用。作者利用静电纺丝技术，通过调整PLA与PGA的复合比例，制得5种PLA/PGA复合纳米纤维膜，考察了PLA与PGA的不同质量比对复合纳米纤维膜的降解行为及生物相容性的影响。

1 实验

1.1 主要试剂和仪器

PLA、PGA：纤维级粒料，东华大学纤维改性国家重点实验室提供；六氟异丙醇：光谱纯，上海德默医药科技有限公司产；磷酸盐缓冲液：上海易势化工有限公司产；磷酸二氢钾(KH2PO4)、一水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·H2O)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)：均为分析纯，国药集团提供。

静电纺丝设备：实验室自制； FD-1A-50型冷冻干燥机：北京博医康仪器有限公司制； DSC 822型差示扫描量热仪：瑞士梅特利-托利多公司制； S-4800型扫描电子显微镜：日本HITACHI公司制； Instron 5969型电子万能试验机：美国Instron公司制。

1.2 PLA/PGA复合纳米纤维膜的制备

将PLA、PGA以不同质量比混合并投入六氟异丙醇中，在50 ℃下磁力搅拌直至粒料全部溶解，得到PLA与PGA总质量分数为10%的微黄色透明的静电纺丝溶液。在25 ℃和相对湿度30%的环境下，将得到的静电纺丝溶液转入塑料注射器制成的喷丝管中，设置电源电压18 kV、注射泵推进速度15 μL/min，采用直径为1.2 mm的喷丝头进行静电纺丝，以接地平面屏接收，接收距离为15 cm。收集到的试样用去离子水洗净并用滤纸吸去表面水分，再用冷冻干燥机于-50 ℃下干燥24 h以上直至恒重，得到PLA/PGA纳米纤维膜。其中，PLA与PGA质量比为100:0，90:10，80:20，70:30，60:40的PLA/PGA纳米纤维膜试样分别标记为0#，1#，2#，3#，4#。另外，纯PGA无法纺丝，将PGA粉末标记为5#试样。

1.3 PLA/PGA纳米纤维膜的体外降解实验

降解液的配制：使用磷酸盐缓冲液模拟人体内降解环境，依次称取8.0 g NaCl、0.2 g KH2PO4、1.56 g Na2HPO4·H2O、0.2 g KCl，溶解于磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后，定容为1 000 mL的降解液，以备使用。

体外降解实验：将不同复合比的PLA/PGA纳米纤维膜裁剪成50 mm×50 mm(用于降解质量损失测试)及50 mm×10 mm(用于力学性能测试)规格的样条，置于圆形玻璃培养皿中，加入配置好的降解液浸没样条，然后一并放入培养箱中于37 ℃下静置，每隔1 d更换降解液并保持样条浸没状态。每隔5 d进行取样，取样后用去离子水清洗并用滤纸吸去表面水分，再在冷冻干燥机内于-50 ℃下干燥24 h以上直至恒重，分别得到浸没5，10，20，30 d的降解试样。

1.4 分析与测试

热性能：称取PLA/PGA纳米纤维膜试样5～10 mg置于铝坩埚中进行差示扫描量热(DSC)测试。将试样先升温至250 ℃并保温3 min去除热历史，冷却到室温后再以10 ℃/min的升温速率升至250 ℃，记录二次升温的热流。

表面形态：将PLA/PGA纳米纤维膜试样经溅射镀金处理后，采用扫描电镜(SEM)观察其表面形态。

细胞毒性：将PLA/PGA纳米纤维膜裁剪成100 mm×100 mm的大小严格灭菌后置于干净的玻璃培养皿中，加入20 mL高糖培养基，置于二氧化碳细胞培养箱(温度37 ℃，通入CO2体积分数0.5%)中放置72 h得到材料浸渍液。用所制得的材料浸渍液培养小鼠成纤维细胞(L929细胞)，培养时间分别为24，48，72 h，并以cck-8试剂法分别评价其细胞毒性。

细胞黏附形态：将PLA/PGA纳米纤维膜裁剪成合适的大小放置于12孔培养皿中，使用灭菌钢环压住，种入L929细胞，培养72 h后对细胞进行固定脱水，镀金处理后使用SEM观察纳米纤维膜上细胞黏附形态。

体外降解性能：根据体外降解前后PLA/PGA纳米纤维膜试样的质量，计算质量损失率，来表征纳米纤维膜的降解性能。

力学性能：使用电子万能试验机对降解试样进行拉伸实验，测试纤维膜的拉伸强度。试样夹持长度为5 cm，拉伸速率为10 mm/min。

2 结果与讨论

2.1 PLA/PGA纳米纤维膜热性能及表面形貌

PLA/PGA纳米纤维膜去除热历史后的DSC曲线见图1，相关结晶特征数据如熔点(Tm)和熔融热焓(∆Hm)列于表1。从图1和表1可以看出：纳米纤维膜中PLA和PGA相互影响导致各自的热性能发生明显变化；PGA开始结晶时，熔点较低的PLA仍呈熔体状态并对PGA的结晶造成阻碍，使PLA/PGA纳米纤维膜的∆Hm降低且Tm出现双峰，其中高温峰值与纯PGA的Tm相比变化不大，这是共混物中PGA富集区形成的完善程度高的结晶的贡献，而PGA富集程度低的区域中其分子运动受到PLA的影响、结晶完善程度降低，从而出现温度相对较低的熔融峰，且峰值随PLA含量增加而降低；而PLA开始结晶时，PGA已完成结晶且晶粒会成为成核剂促进PLA的结晶，因此与纯PLA相比共混膜中PLA的∆Hm增大、Tm增高，但PGA含量增加、晶核数量增多时诱导生成的PLA晶粒也多，晶粒如同物理交联点又会使PGA的活动能力受限，故PLA的∆Hm增大的程度会随PGA含量增加而减弱，这也是4#试样的Tm又降下来的原因。二者的结晶特性能互相影响的原因，是类似于同系物的PLA和PGA相容性良好、二者大分子之间相互分散程度高所致。

由此可见，PLA与PGA相容性良好，这将有利于获得力学性能良好的纳米纤维膜并发挥二者的协同作用。

图1 PLA/PGA纳米纤维膜的DSC曲线Fig.1 DSC patterns of PLA/PGA nanofiber membrane

表1 PLA/PGA纳米纤维膜的DSC数据Tab.1 DSC data of PLA/PGA nanofiber membrane

除了纯PGA因结晶度高难以溶解完全而未能进行静电纺丝外，其他组成的静电纺丝溶液尽管黏度随PGA含量增加而有所增大，但均能顺利地经静电纺丝制得形貌良好的纳米纤维膜。从图2可知，5种不同复合比例的PLA/PGA纳米纤维膜的纤维粗细均匀，表面光滑，无明显差异，PGA含量最高的4#试样的纤维形貌也是表面平整、光滑，无串珠的形成，无明显纤维间粘连现象。这说明在本实验选择的复合比例和浓度范围内，PLA/PGA溶液具有良好的静电纺丝性能。

图2 PLA/PGA纳米纤维膜表面的SEM照片Fig.2 Surface SEM images of PLA/PGA nanofiber membrane

2.2 PLA/PGA纳米纤维膜的生物相容性

cck-8试剂所含有的WST-8在电子载体的作用下可被细胞线粒体中的脱氢酶还原为水溶性的黄色甲臜产物，生成数与活细胞数量成正比，因此，用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其吸光度(O.D.值)，可间接反映活细胞数量。采用cck-8法对不同PLA/PGA复合比例的5种纳米纤维膜对L929细胞的增殖率进行评价，同时设置空白样对照，测试结果见表2。

表2 不同培养时间下PLA/PGA纳米纤维膜的O.D.值Tab.2 O.D.value of PLA/PGA nanofiber membrane at different culture time

从表2可以看出：随着培养时间的增加，空白样与测试样的O.D.值均增大，表明5种纳米纤维膜均未表现出细胞毒性且有利于细胞增殖；随着PGA含量的增加，测试样的O.D.值也不断增大，培养72 h后，4#试样的O.D.值明显大于0#试样(纯PLA纤维膜)，这与PGA的生物相容性优于PLA相符合。

细胞可以较好地在材料表面生长并且伸展，则表明材料具有更好的生物相容性。图3为L929细胞接种于5种纳米纤维膜表面72 h后的SEM照片，观察所拍摄的细胞照片可以发现L929细胞在纤维表面能够良好的生长、粘附在纤维上，细胞在纤维表面伸展，生长形态良好；相比0#试样，4#试样表面细胞表现出更为伸展的形貌，并且细胞与纤维的粘合程度更深(生长在纳米纤维膜内)。这表明随着PGA含量的增加，细胞在纳米纤维膜表面生长粘附形貌更好，细胞增殖数也增高，PLA/PGA纳米纤维膜相比纯PLA纤维膜表现出更好的生物相容性。

图3 PLA/PGA纳米纤维膜表面的细胞黏附形态Fig.3 Morphology of cell adhesion on the surface of PLA/PGA nanofiber membrane

2.3 PLA/PGA纳米纤维膜的体外降解性能

从图4可以看出，相比未降解的PLA/PGA纳米纤维膜(图2)，不同复合比例的纳米纤维膜在体外降解30 d后，纤维膜表面光洁度下降，表面附着降解后的小颗粒，损伤增加，出现了细纹，纤维粗细均匀度也下降，并且随着PGA含量的提高，纳米纤维膜表面细纹增多，纤维表面粗糙度增加。纤维表面形态的变化大说明PLA/PGA纳米纤维膜的降解速率大，这与PGA的降解速率大于PLA相一致。

图4 体外降解30 d后PLA/PGA纳米纤维膜表面的SEM照片Fig.4 Surface SEM images of PLA/PGA nanofiber membrane after 30 days of degradation in vitro

PLA/PGA纳米纤维膜在体外降解的质量损失情况如图5所示。从图5可以看出：在30 d的体外降解过程中，纯PLA纳米纤维膜(0#试样)因PLA本身的降解较慢，体外降解的质量损失最小，体外降解30 d后质量损失只有5.4%，其降解速率也相对恒定；1#～4#PLA/PGA纳米纤维膜在体外降解初期(5 d内)，其降解速率快、质量损失大，质量损失的趋势随PGA含量的增加而更加明显，1#试样质量损失率为3.36%，4#试样的质量损失率达5.93%，这是由PGA的快速降解特性所决定；但是，在体外降解后期，1#～4#PLA/PGA纳米纤维膜的降解速率明显低于纯PLA纳米纤维膜，并且从总体上看PGA含量越高，降解速率越慢，这是由于PGA的存在使PLA的结晶程度提高、无定形区含量降低造成的，因为水分子是首先进入结构疏松的无定形区使酯键断裂而引起降解。

图5 PLA/PGA纳米纤维膜体外降解的质量损失率随降解时间的变化Fig.5 Change of mass loss rate of PLA/PGA nanofiber membrane with degradation time in vitro■—0#试样；●—1#试样；▲—2#试样；▼—3#试样；◆—4#试样

由于PLA的相对分子质量远高于PGA，故PLA/PGA复合纳米纤维膜的力学性能主要取决于PLA。从图6a可以看出，加入PGA后，PLA/PGA纳米纤维膜的拉伸强度均低于纯PLA纳米纤维膜，且随着降解的进行，PLA、PGA在水分子的作用下分子链逐渐裂解，纤维膜的拉伸强度随降解时间的增加持续降低。但进一步考察纳米纤维膜在降解过程中的强度损失率(见图6b)，从总体上看，在不同的PGA添加量下，PLA/PGA纳米纤维膜的拉伸强度损失率要低于纯PLA纳米纤维膜。在降解初期(5 d内)，尽管PLA/PGA纳米纤维膜的降解速率快，但其贡献主要是PGA提供，仅PGA含量最高的4#试样的拉伸强度损失率为24.4%，略高于纯PLA纳米纤维膜的14.7%，其他PLA/PGA纳米纤维膜的拉伸强度损失率仍低于纯PLA纳米纤维膜；随着降解时间的延长，PLA/PGA纳米纤维膜的降解速率更低，降解30 d后，4#试样的拉伸强度损失率为51.7%，也低于0#试样的60.0%。因此，在PLA中引入PGA，一方面可以调整PLA的降解速率以利于制件在有效时间内维持必要的力学性能，另一方面可以利用PGA本身的快速降解来保证总体的降解量，提供良好的生物相容性。

图6 PLA/PGA纳米纤维膜体外降解过程中拉伸强度及其损失率随降解时间的变化Fig.6 Change of tensile strength and its loss rate of PLA/PGA nanofiber membrane with degradation time in vitro■—0#试样；●—1#试样；▲—2#试样；▼—3#试样；◆—4#试样