血清CCL4水平和绝经后骨质疏松症严重程度相关性研究

杨剑 李清雪 仝瑞晓 陈景伟

1.河北省优抚医院康复科，河北 石家庄 050051 2.石家庄市第四医院妇科，河北 石家庄 050011 3.邯郸市中医院妇科，河北 邯郸 056000 4.河北中医学院中西医结合妇产科学教研室，河北 邯郸 050200

骨质疏松是人类骨骼的一种极其常见的疾病，其特点是骨强度下降，脆性骨折风险显著增加[1]。女性比男性更常见，由于绝经后雌激素水平下降，其发病率显著增加[2]。骨质疏松被认为是一种涉及内分泌和遗传因素的多因素疾病。骨质疏松的主要诊断依据是骨密度以及腰痛[3]。然而，骨密度降低和影像学改变，如骨小梁减少或骨折，通常被解释为中晚期骨质疏松的指征。为了早期发现骨质疏松患者骨代谢的变化，必须采用更新、更有效、更可靠的疾病监测手段。CCL4，又称巨噬细胞炎症蛋白-1β，与破骨细胞活性和骨代谢疾病的病理进程有关[4]。CCL4对多种细胞具有潜在的趋化作用，包括对冠状动脉内皮细胞、未成熟树突状细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等不同类型的细胞具有趋化作用。破骨细胞的迁移已被确定是包括骨质疏松在内的一些病理条件下的一个关键过程[5]。一项横断面临床研究发现，骨质疏松患者的血清CCL4水平显著高于健康对照组[6]。目前关于绝经后骨质疏松症患者血清CCL4水平和骨质疏松症严重程度目前研究有限，本研究的旨在探索绝经后骨质疏松症患者血清CCL4水平和骨密度之间的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

2017年4月至2019年4月，66例绝经后女性患者(包括32例腰椎骨折)诊断为PMOP。骨质疏松定义为T值<-2.5。本研究的纳入标准：50岁或以上绝经后骨质疏松症患者。排除标准包括有骨骼系统疾病、癌症、肾脏疾病、心力衰竭、缺血性心脏病和糖尿病的患者。此外，在2个月内接受了破骨细胞抑制剂和/或有机钙治疗的患者也被排除在外。同时选择68例骨密度正常的绝经后妇女[绝经后非骨质疏松妇女(PMNOP)]和67例育龄健康妇女作为对照组。本研究方案都得到医院伦理委员会的批准，所有受试者都签署书面知情同意书。

1.2 指标评估

采用Oswestry残疾指数(ODI)和视觉模拟评分法(VAS)评价PMOP患者的功能状态和症状严重程度。ODI是对10种日常生活活动能力的评估，包括疼痛强度、旅行、社会活动、性活动、睡眠、站立、坐姿、步行、举重和个人卫生。严重程度评分越高，表示残疾程度越高。采用10 cm水平VAS量表评价下肢和腰痛的程度。研究方案将中度至重度疼痛定义为VAS>3，而轻度疼痛由VAS<3表示。

脊柱骨折的影像学评估基于脊柱成像的Genant半定量法[7]。骨折分为3级，椎体高度降低20%～25%、降低26%～40%、降低>40%分别为1级、2级和3级。

所有受试者在禁食过夜后进行静脉采血。血液被收集到空置管中，然后立即离心以减少糖酵解。血清样本在-80 ℃保存，直到检测为止。用定量双抗体夹心酶联免疫吸附试验试剂盒(Quantikine；R&D Systems，MN)对PMOP、PMNOP女性和健康对照者的CCL4水平进行盲法分析。CCL4批内和批间变异系数分别为4.36 %和3.25%。检测范围为31.2～2 000pg/mL。检测炎症标志物IL-6和血清Ⅰ型胶原C端末端肽(CTX-I)水平。

1.3 统计学处理

通过SPSS 21.0软件分析所有研究的数据。结果以均数±标准差或中位数(四分位数范围)表示。 通过Kolmogorov Smirnov检验评估数据分布的正态性。使用Mann WhitneyU检验或学生t检验分析两组之间血清CCL4水平的差异。通过单因素方差分析或Kruskal Wallis分析，然后进行Tukey Posthoc分析，确定三组之间的差异。行Spearman或Pearson相关分析以评估CCL4血清水平与疾病严重性相关性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

表1描述了本研究的所有参与者的基线临床特征。患者队列包括66名PMOP女性，平均年龄(62.4±5.1)岁；68名年龄匹配的PMNOP女性，平均年龄(60.7±4.4)岁和67名健康育龄妇女，平均年龄(42.7±4.1)岁。一般人体特征参数(包括BMI和年龄)在PMOP和PMNOP组之间差异无统计学意义。与PMNOP和对照组相比，PMOP中IL-6和CTX-1标志物显著升高。此外，观察到PMOP组患者的股骨颈和L1-L4BMD显著低于PMNOP和健康对照组。

与PMNOP和对照相比，PMOP中血清CCL4水平增加(P<0.05)，见表1和图1。PMNOP与健康对照组血清CCL4水平差异无统计学意义。此外，与PMOP中的非骨折组相比，骨折组血清CCL4水平显著升高(P<0.05)，见图1。

表1 受试者的基线临床特征参数及骨密度

图1 血清CCL4水平比较Fig.1 Comparison of serum CCL4 levels

使用Genant分级系统，PMOP相关骨折患者被分为3个不同的组。12名患者被分为1级，11名被分为2级，9名被分为3级。Genant 3级血清CCL4水平显著高于Genant1级(P<0.05)。虽然Genant 3级与Genant 2级、Genant 2级与Genant 1级的差异无统计学意义；但是呈现一种趋势，具有较高Genant等级的患者表现出较高的血清CCL4水平。血清CCL4水平与Genant等级呈正相关(r=0.580，P<0.05)。见图2。

图2 血清CCL4水平与Genant分级和BMD之间的相关性Fig.2 Associations between serum CCL4 level and Genant grade and BMD

进一步检测血清CCL4水平以探讨其与PMOP患者的BMD和Genant分级的相关性。发现较高的CCL4水平与较低的股骨颈BMD(r=-0.396，P=0.001)和较低的腰椎(L1-L4)BMD相关(r=-0.364，P=0.003)，见图2。然而，PMNOP与健康对照组比较，血清CCL4水平与股骨颈和腰椎BMD无显著相关性。为了说明CCL4水平是否与PMOP的症状严重程度相关，进一步探讨了血清CCL4水平和VAS以及ODI之间的关系。发现CCL4水平与VAS(r=0.455，P<0.001)和ODI(r=0.499，P<0.001)呈正相关，见图3。另外血清CCL4水平与CTX-1(r=0.432，P<0.001)和IL-6(r=0.437，P<0.001)也呈正相关，见图3。但血清CCL4水平与PMNOP和健康对照组的CTX-1和IL-6水平无显著相关性。

图3 血清CCL4水平与VAS评分、Oswestry指数、血清I型胶原和IL-6水平的相关性Fig.3 Association of serum CCL4 levels with VAS scores, Oswestry indices, serum type I collagen and IL-6 levels

3 讨论

本研究旨在确定PMOP患者血清CCL4水平与疾病严重程度之间的关系。本研究发现和健康对照组相比，PMOP血清CCL4水平显著升高。此外，血清CCL4水平与PMOP女性中较低的BMD、骨折、临床严重程度和骨质疏松相关标志物呈相关性。在调整年龄和BMI后，这些差异仍然很大。

现有研究[8]证实，免疫系统对骨质疏松症的发病机制有重要作用，炎性趋化因子在骨质疏松症中起关键作用的是骨重建因子。通过参与刺激破骨细胞祖细胞的成熟和迁移，趋化因子信号与经典M-CSF/RANKL介导的破骨细胞分化途径有关[9]。以前的研究，包括小鼠和原代人类细胞培养的遗传实验，已经证明趋化因子在生理条件下影响破骨细胞的分化和迁移[10-11]。本研究发现CCL4水平与股骨颈和L1-L4腰椎的BMD呈负相关。此外，CCL4水平与椎体骨折的影像学分级呈正相关。这两项研究结果表明CCL4可能在破骨细胞活性中起重要作用。

破骨细胞来源于单核细胞/巨噬细胞前体细胞，后者又是造血祖细胞的后代。骨吸收是一个动态过程，需要破骨细胞分化，激活和迁移到再吸收部位[12]。在一项体外细胞研究中，在向培养基中加入特异性抗CCL4抗体后，RANKL诱导的迁移破骨细胞数量显着下降[13]。在多发性骨髓瘤细胞中，CCL4可能是溶骨性病变发展中的主要破骨细胞激活因子[14]。所有这些发现都暗示CCL4是破骨细胞活性所必需的。本研究表明血清CCL4水平与疼痛和功能显著相关。

研究认为神经系统通过控制骨重建和局部血流来调节骨组织生物学的性能[15]。实际上，已经发现周围神经系统密切调控骨骼功能。高度支配骨骼系统的神经纤维包括富含肽的降钙素基因相关肽阳性纤维和受体激酶A中的A-δ原肌球蛋白等[16]。尽管年龄导致骨质量减少，但支配骨骼的神经元数量在整个人的生命周期内保持相对静止[17]。骨骼中神经连接的存在直接影响骨重建，维持内部动态平衡并控制合成代谢和分解代谢的骨代谢。一项涉及使用小鼠PSNL模型的研究调查了CCL4如何影响神经性疼痛[18]。发现经历坐骨神经损伤的小鼠模型在施万细胞和损伤部位的巨噬细胞中具有CCL4表达的增加。此外，CCL4抗体能够减轻这些病理特征。

总之，这些发现表明CCL4可能是促进PMOP患者疼痛感的重要因素。我们进一步检查了血清CCL4水平与骨转换标志物CTX-1以及骨质疏松症相关炎症标志物IL-6之间的关系。已经证实血清CTX-1值在骨吸收加速的条件下升高；通过分析血清CTX-1水平，可以检测到骨质疏松症中骨转换增加以及继发于绝经后骨吸收增加[19]。IL-6已被确定为炎症细胞因子，主要在绝经后期刺激破骨细胞转化[20]。本研究表明血清CCL4与血清CTX-1和IL-6之间的显著相关性。

综上，本研究发现，与PMNOP和健康对照者相比，PMOP患者血清CCL4水平显著升高。较高的CCL4水平与症状和影像学严重程度增加以及较低的BMD相关。目前的研究表明CCL4具有能够预测PMOP疾病严重程度的生物标志物的潜力。