载他克莫司可注射温敏型水凝胶促牙周组织再生的研究

陈 希， 任春霞， 刘莉莉， 陈雨蒙，郑梦丹， 崔家森， 卢金金， 孙宏晨,

（1.吉林大学口腔医学院病理科，吉林 长春130021；2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林长春130021；3.中国医科大学附属口腔医院口腔病理科，辽宁 沈阳110001；4.吉林大学口腔医院牙周科，吉林 长春130021；5.吉林大学口腔医院儿童口腔科，吉林 长春130021）

牙周炎是一种由微生物和宿主免疫系统之间相互作用引起的慢性炎症性疾病。该疾病不仅能破坏牙齿的支持结构（牙龈、牙周膜及牙槽骨），导致牙齿松动脱落，同时也与全身系统性疾病关系密切[1-2]。现有的牙周治疗手段，如牙周基础治疗、翻瓣术及自体骨移植术等仅能减小牙周袋和根分叉损害的探诊深度，无法实现牙周组织的完全恢复[3-4]。因此，临床上亟须开发具有促进牙周组织再生作用的新型牙周炎治疗制剂。

FK506也称他克莫司（tacrolimus），是从链霉菌属中提取出来的一种抗生素，也是临床常用的强效免疫抑制剂[5]。目前的多项研究发现，FK506具有抗炎，促进骨形成和骨缺损修复的作用[6-7]。由于抗炎与促进骨形成是促进牙周组织完全恢复的关键靶点[8]。因此，这些研究提示FK506在牙周炎的治疗中具有良好的应用前景。

选择合适的载体是提高药物效率的关键[9]。水凝胶作为应用较广泛的药物载体，可被制成可注射剂型。可注射型水凝胶具有临床操作简便，注射所需创口小，液体状态下具有流动性以充填于不规则组织缺损腔隙等诸多优点[10-12]。此外，该载体具有药物缓释性能，能够实现长期、持续、少量给药，使所包载的药物稳定、持续、高效地在局部释放，并发挥作用[13]。

本研究拟制备载FK506可注射温敏型水凝胶，研究其物理性能。采用大鼠牙周炎模型，研究其促牙周组织再生的功能；并通过体外细胞研究，探讨该制剂的生物安全性，以期为FK506在牙周炎治疗的临床应用中提供参考。

1 材料和方法

1.1 载FK506水凝胶的制备及形态观察

壳聚糖（CS）、β-甘油磷酸钠、明胶、FK506均购自美国Sigma-Aldrich公司。取5 mg FK506粉剂，溶于0.1 mL的无菌二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）中，配置成质量浓度为50 mg/mL的FK506储存液，用无菌磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）将FK506储存液稀释至3.27μg/mL，备用。质量分数为2%CS、56%β-甘油磷酸钠溶液（含20μg/mL的FK506）及0.5%明胶水溶液按照不同体积比（10∶2∶0.25）磁力搅拌并振荡混匀，调节pH至7.0。密封后置于37℃水浴恒温箱中孵育，待其形成固态凝胶后冷冻干燥，扫描电镜（JEOL公司，日本）下观察其显微结构。

1.2 大鼠牙周炎模型建立

将50只雄性Wistar大鼠（体质量180~220 g，6~7周龄，清洁级，购自吉林大学生命科学院实验动物中心）随机分为5组，每组10只。实验分组：空白组（正常Wistar大鼠，未建模）、牙周炎组（放置结扎丝）、牙周炎+水凝胶组（放置结扎丝，同期注射水凝胶）、牙周炎+载FK506水凝胶组（放置结扎丝，同期注射载FK506水凝胶，FK506质量浓度：3.27μg/mL）及牙周炎+FK506组（放置结扎丝，同期注射FK506溶液，FK506质量浓度：3.27μg/mL）。Wistar大鼠经10%水合氯醛（20 mg/kg）麻醉；置结扎丝于大鼠双侧上颌第一磨牙与第二磨牙之间，并将结扎丝环绕上颌第一磨牙牙颈部1圈[14]；同期分别注射25μL相应溶液至结扎丝所在牙位牙槽嵴顶的黏骨膜下。常规动物复苏及饲养。药物注射频率为每3天1次，持续2周。

1.3 Micro-CT图像分析

全麻状态下，用4%多聚甲醛心脏灌流固定后，取大鼠双侧上颌骨置于4%多聚甲醛溶液中继续固定24 h。采用Micro-CT进行扫描（电流：114 mA；电压：70 kV；曝光时间：0.3 s）。选定感兴趣区域（region of interest，ROI），测量上颌第一磨牙和第二磨牙间的牙槽骨区域。测量的相应参数：骨矿物质密度（bone mineral density,BMD）；组织矿物质密度（tissue mineral density,TMD）；骨体积分数 （bone volume/total volume,BV/TV）；骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）；骨小梁数目（trabecular number,Tb.N）；骨小梁分离度（trabecular separation,Tb.Sp）。

1.4 形态学分析

将上颌骨标本置于10%的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片（切片厚度为3.0μm）。常规HE染色，中性树脂封片，显微镜下观察炎性细胞的分布和牙周组织的再生效果。

1.5 免疫组织化学分析

取3.0μm石蜡切片，常规脱蜡至水，于枸橼酸钠缓冲液中进行微波抗原修复；PBS冲洗3次，每次5 min，3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶10 min；PBS冲洗3次，每次5 min，滴加山羊血清置室温封闭1 h，滴加兔抗大鼠MMP-9（1∶500）、兔抗大鼠COX-2（1∶500）抗体，4℃孵育过夜；PBS冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记的二抗置室温孵育10 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素生物素溶液置室温孵育20 min；二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）显色，苏木精复染，中性树脂封片，显微镜下观察、拍照。

1.6 MTT法检测载FK506水凝胶对细胞增殖活性的影响

Wistar大鼠处死后取股骨，采用全骨骨髓法提取、分离并培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）[15]。体外细胞实验分组：空白组、水凝胶组、载FK506水凝胶组及FK506组。采用Transwell共培养系统（0.4μm孔径，6孔板，美国Costar公司），在小室内注入水凝胶，置于37℃、5% CO2的孵箱内，待其凝固。将消化收集的第3代BMSCs以2×105个/孔的密度接种于Transwell下室中。共培养48 h后，移走上层小室，加入MTT（200μL/孔）至下室，终质量浓度为5 mg/mL。37℃孵育4 h，弃培养基，每孔加入1.5 mL二甲基亚砜（DMSO）混匀，酶标仪（深圳雷杜生命科学技术有限公司）测490 nm波长处吸光度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 10.00软件进行统计学处理。各实验组和空白组样本均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水凝胶的形貌表征观察

采用Nano measure软件分析得出，以CS、β-甘油磷酸钠、明胶为原料的可注射温敏型水凝胶的孔径均等，平均直径为40～80μm。该水凝胶有利于细胞爬入、营养物质吸收和细胞代谢废物排出。

2.2 载FK506水凝胶促牙周组织再生作用

本研究采用Micro-CT检测大鼠上颌骨磨牙区牙槽骨的修复情况（图1）。釉牙骨质界与牙槽嵴顶（cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC）之间的垂直距离增加表示牙槽骨破坏。实验2周后，牙周炎组CEJ-ABC平均距离比空白组大50%，且差异有统计学意义（P＜0.01）。该结果表明我们成功地建立了牙周炎模型；牙周炎+水凝胶组和牙周炎+FK506组的CEJ-ABC平均距离仍大于空白组，但与牙周炎组相比，CEJ-ABC平均距离已下降；经载FK506水凝胶处理2周后，CEJ-ABC平均距离与空白组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见图2。

Micro-CT定量分析显示，与空白组相比，我们观察到牙周炎组BMD（P＜0.001）、TMD明显减小（P＜0.01），BV/TV明显降低（P＜0.01），Tb.Th也有所降低（P＜0.05），Tb.N无明显变化，Tb.Sp增加（P＜0.01）。以上数据表明我们成功建立了大鼠牙周炎模型，结扎丝的机械刺激及炎症因素等导致ROI骨组织明显破坏。与牙周炎组相比，牙周炎+水凝胶组及牙周炎+FK506组的TMD和BV/TV显著增加（P＜0.05），其中牙周炎+水凝胶组Tb.Sp有所降低，但差异不明显。这表明单独应用水凝胶或者FK506可以在一定程度上缓解牙槽骨破坏的严重程度。此外，水凝胶与FK506联合应用后（牙周炎+载FK506水凝胶组），其BMD比牙周炎组明显增大（P＜0.05），TMD增 加33.3%（P＜0.05），BV/TV增 加240%（P＜0.05），Tb.Sp减少55.9%（P＜0.001），Tb.N增加81%（P＜0.001），Tb.Th无明显变化。这些结果表明，负载FK506的水凝胶可以有效地协同抑制炎症并促进牙周组织再生。详见图3。

图1 Micro-CT扫描结果显示牙槽骨再生情况Figure 1 Micro-CT images showing regeneration of the alveolar bone

图2各组CEJ至ABC的距离比较Figure 2 Quantitative comparison on the distance from CEJ to ABC

2.3 组织学分析结果

应用HE染色法评估炎症状况和牙周膜再生情况。如图4A～4C所示，空白组牙周组织结构清晰，结合上皮紧贴牙釉质表面，牙周纤维排列整齐，牙骨质完整，牙周组织内未见炎性细胞浸润或牙槽骨吸收。然而在牙周炎组（图4D～4F），上颌第一磨牙和第二磨牙牙间乳头消失，结合上皮向牙根部迁移形成深牙周袋，牙周纤维结构紊乱，牙骨质中可见吸收性凹坑，牙周组织中可以看到大量中性粒细胞及少量淋巴细胞和浆细胞浸润，牙槽骨吸收至根尖附近。这些结果表明我们成功地建立了大鼠牙周炎模型。与牙周炎组相比，牙周炎+水凝胶组（图4G～4I）及牙周炎+FK506组（图4M～4O）的牙槽骨破坏程度减弱，并可见清晰的嗜碱性反折线，牙周组织内可见少量中性粒细胞浸润。在牙周炎+载FK506水凝胶组（图4J～4L）中，几乎没有炎性细胞浸润或牙槽骨破坏，牙骨质完整，并且可以在根叉区及上颌第一磨牙与第二颌磨牙之间看到新生骨组织，牙周状况与空白组相比，差异无统计学意义。HE染色结果显示，FK506与可注射温敏型水凝胶联合应用（牙周炎+载FK506水凝胶组）可以有效地控制炎症，促进牙周组织再生。整个实验过程中由于结扎线的刺激，3个实验组中的牙间乳头和结合上皮并未完全恢复。

图3各组Micro-CT相关参数比较Figure 3 Comparison of Micro-CT related parameters of each group

图4牙周组织HE染色结果Figure 4 HE staining of the periodontium

为了进一步研究载FK506水凝胶的抗炎作用，我们采用免疫组织化学染色法观察牙周组织中炎症因子COX-2和MMP-9的表达水平。与空白组相比，牙周炎组的牙周组织中有大量COX-2和MMP-9阳性细胞，牙周炎+水凝胶组和牙周炎+FK506组的COX-2和MMP-9阳性细胞数量略有下降，但仍高于空白组；然而在牙周炎+载FK506水凝胶组中只有散在分布的COX-2和MMP-9阳性细胞，这表明水凝胶缓释FK506有效地控制了牙周组织炎症。详见图5。

图5牙周组织免疫组织化学染色结果（X400）Figure 5 Immunohistochemical staining results of the periodontal tissue（X400）

2.4 载FK506水凝胶对细胞增殖活性的影响

MTT结果表明，水凝胶及其负载药物FK506与BMSCs细胞共培养48 h后，细胞增殖趋势略有增加，但差异无统计学意义（P＞0.05，图6）。此结果表明水凝胶及其负载药物不会引起细胞毒性或抑制细胞增殖。

图6 MTT法检测载FK506水凝胶对BMSCs增殖活性的影响Figure 6 The effect of FK506-containing hydrogel on the proliferation of BMSCs by MTT method

3 讨论

牙周炎是菌斑微生物与宿主免疫系统间复杂的相互作用所致的炎症性疾病。由牙周炎引起的牙槽骨吸收是成人失牙的首要原因，牙周炎会影响人们的面容美观，营养吸收甚至心理健康。现有的牙周治疗手段仅能减小牙周袋和根分叉损害的探诊深度，部分恢复牙周附着，遭到破坏的牙周组织无法完全恢复其生理结构和功能。牙周炎治疗的关键一方面是抑制牙周炎症，另一方面是促进牙周组织再生，而现有的治疗方法很难同时实现这两方面的要求。因此，寻找一种既能控制牙周炎症，并能进一步实现牙周组织再生与修复的治疗手段仍是该领域面临的难题。

牙周炎发生、发展过程中，在以牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）为主介导的病原体相关分子模式（pathogen associated molecule patterns,PAMPs）作用下[16]，外周血和龈沟中的中性粒细胞、单核/巨噬细胞内模式识别受体被激活，释放大量的前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）[17]。PGE2通过促进核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappaB ligand,RANKL）表达并抑制骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达从而对破骨细胞的形成起到积极作用。因此，抑制炎性因子如PGE2和MMPs的分泌对于控制牙周炎具有重要作用。研究表明，FK506可通过抑制核转录因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）的活性来减少MMPs的产生[18]，通过抑制炎性细胞分泌白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）来减少PGE2的产生[19]，进而抑制RANKL的表达，从而阻止破骨细胞的分化并控制牙槽骨的吸收。同时COX-2作为催化花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶,在炎症反应的启动环节具有关键作用[20]。本研究中，我们用结扎线模拟人的牙结石，促进牙菌斑的积累并引起牙周组织炎症。HE染色结果显示，经过载FK506水凝胶处理2周后，牙周组织炎症反应明显减轻。同时，免疫组织化学染色结果显示，牙周炎+载FK506水凝胶组中只有散在的COX-2和MMP-9阳性细胞，这证实了FK506在牙周炎治疗中的抗炎作用。

近年来已有诸多研究发现FK506在促进骨组织再生中起重要作用[6-7]。我们目前的实验结果表明，牙周炎+载FK506水凝胶组与空白组CEJ-ABC平均距离及Micro-CT测得的相关指标差异无统计学意义，这表明FK506在控制炎症微环境的基础上还可以促进牙槽骨的再生。

综上所述，载FK506可注射温敏型水凝胶可以有效地控制牙周组织炎症，减轻牙槽骨的破坏程度，在牙周组织再生中具有良好的研究价值和应用前景。