昆布多糖对大鼠心肌缺血/再灌注模型葡萄糖调节蛋白-78及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶12蛋白表达含量的影响

党淼，李铁成

(锦州医科大学附属第三医院麻醉科，辽宁 锦州 121000)

由于我国心血管疾病城乡发病率越来越高和逐渐低龄化，经皮冠状动脉介入治疗等冠状动脉再通恢复冠状动脉血流的技术愈趋成熟，心肌缺血再灌注损伤缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)作为影响心血管疾病预后的重要因素，得到了广泛关注[1]。近年研究表明[2]，内质网应激参与了MI/RI的发生发展，并与氧自由基生成过多、钙超载等机制相互作用。在病理因素如缺血、缺氧、炎症的作用下，内质网蛋白质的合成运输障碍，腔内堆积大量的未折叠或错误折叠的蛋白，激活葡萄糖调节蛋白-78(glucose regulated protein-78，GRP-78)，启动内质网应激。当损伤持续存在时，内质网应激启动凋亡信号通路GRP-78/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶12(cysteine-dependent aspartate-specific protrases 12，Caspase 12)等途径诱导细胞凋亡[3]。因此，内质网应激在MI/RI的病理生理环节中具有重要作用[4]。

昆布多糖(Laminarin，Lam)是存在于昆布中的大分子多糖物质。国内外研究表明，Lam具有抑菌、抗肿瘤、调节免疫功能、调节血脂、抗氧化、降血糖等广泛的生物学活性[5]，具有重要的研究与开发价值。本研究建立大鼠MI/RI模型，观察大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)、髓过氧化物(myeloperoxidase，MPO)的含量，以及心肌组织中GRP-78、Caspase 12、B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的蛋白表达情况，根据心肌组织损伤程度进一步探讨Lam对大鼠心肌是否有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Lam(北京索莱宝生物科技有限公司，中国北京)；CK-MB试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，中国上海)；MPO试剂盒(南京建成生物工程中心，中国南京)；兔抗鼠GRP-78、Bcl-2多克隆抗体(美国Santa cruz公司，美国)；内参兔抗鼠β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G(北京博奥森生物技术有限公司，中国北京)；蛋白提取裂解液、聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶配置试剂盒、BCA(bicinchonininc acid)蛋白浓度检测试剂盒、电化学发光试剂盒(海门市碧云天生物技术研究所，中国海门)；辣根过氧化酶标记山羊抗兔、山羊抗小鼠Ig G(圣克鲁斯生物技术有限公司，中国上海)；其它由锦州医科大学动物实验科研中心的实验室提供。

1.2 实验动物与分组

清洁健康的雄性SD大鼠32只，体质量(200±20)g，由锦州医科大学动物实验科研中心提供，随机数表法分为4组，每组8只。(1)假手术组(sham组)：普通饲料及饮用水喂养2周，开胸后冠状动脉穿线不结扎；(2)MI/RI组：开胸后冠状动脉穿线，结扎45 min，再灌注180 min；(3)低剂量组：术前Lam 50 mg/kg灌胃2周，开胸后穿线，结扎45 min，再灌注180 min；(4)高剂量组：术前Lam 100 mg/kg灌胃2周，开胸后穿线，结扎45 min，再灌注180 min。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠MI/RI模型 术前12 h禁食不禁水。20%乌拉坦(6 ml/kg)腹腔注射进行麻醉。仰卧位并将四肢固定于实验台上，针形电极插入大鼠四肢皮下，连接心电图机，气管插管接人工呼吸机(频率55次/min，潮气量15 ml/kg)。沿胸骨左侧旁行切口，剪开皮肤。用止血钳钝性分离肌肉，充分暴露第2、3根肋骨，剪断肋骨，充分暴露心包，小心剪开心包膜，充分暴露心脏。除sham组穿线不结扎外，各组均在肺动脉圆锥和左心耳之间左前降支冠状动脉处穿一缝合线，穿过一个有活口的硅胶管，系紧结扎线，45 min后剪掉带有活口的硅胶管的结扎线，使心肌血流恢复，随后保持180 min再灌注。结扎冠状动脉后见心电图ST段立即抬高；再灌注时抬高的ST段回落50%以上为造模成功的标志。

1.3.2 酶联免疫吸附试验和比色法测定CK-MB和MPO (1)CK-MB：取离心后的血浆上清液，加样，用封板膜封板后置37℃温育60 min，洗涤5次，拍干，加入显色剂，37℃避光显色15 min，加终止液终止反应，测定吸光度(Anm)。(2)MPO：称取心尖组织100 mg制作成样本，通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物，比色法测定产物的生成量，推算MPO含量。

1.3.3 Western blotting检测GRP-78、Caspase 12和Bcl-2 取40 mg大鼠心脏组织加入裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯(polyvinglident fluoride, PVDF)膜，5%脱脂奶的TBST液封闭1 h，洗涤3次，兔抗鼠GRP-78多克隆抗体及兔抗鼠β-actin单克隆抗体(1∶1 000稀释)孵育，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G(1∶5 000稀释)，化学发光法进行成像。Image Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参蛋白，计算目的蛋白和β-actin比值作为目标蛋白的相对表达量。Caspase 12、Bcl-2抗体方法同上。

1.3.4 心肌组织的病理形态学改变 将大鼠心室肌组织放置于4%多聚甲醛溶液中固定。乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，进行HE(hematoxylin-eosin)染色，光学显微镜观察心肌组织病理形态学的变化。

1.3.5 心肌梗死面积测定 实验结束前，经冠状动脉逆行灌注1% Evans Blue 2 ml，将非缺血区蓝染，未被染色区域为危险区(area at risk，AAR)。迅速取出心脏，置于生理盐水中，分离左心室。-20℃冰箱冷冻1 h后，沿心尖至基底部剪成5个2 mm的切片，放入1%氯化三苯基四氮唑红(triphenyltetrazolium chloride，TTC)的磷酸缓冲液中，37℃水浴30 min。染色后梗死区呈灰白色，缺血区呈砖红色。应用Image Pro Plus 6.0软件测量心肌缺血范围和心肌梗死范围。心肌缺血范围=AAR/左室面积(left ventricle，LV)×100%；心肌梗死范围=梗死区面积(infarction size，IS)/AAR×100%。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组CK-MB、MPO的含量比较

与sham组比较，MI/RI组CK-MB、MPO表达水平显著升高(P<0.01)，与MI/RI组比较，低剂量组和高剂量组CK-MB、MPO的表达水平均显著降低(P<0.01)，与低剂量组比较，高剂量组降低更显著(P<0.01；表1)。

表1 各组CK-MB、MPO表达量的比较

2.2 各组GRP-78、Caspase 12、Bcl-2蛋白表达比较

与sham组比较，MI/RI组GRP-78、Caspase 12水平显著升高(P<0.01)，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.01)。与MI/RI组比较，低剂量组和高剂量组GRP-78、Caspase 12的表达水平显著降低(P<0.01)，Bcl-2表达水平显著升高(P<0.01)，与低剂量组比较，高剂量组各蛋白改善水平更为显著(P<0.01；图1，表2)。

图1 各组GRP-78、Caspase 12、Bcl-2表达情况比较

表2 各组GRP-78、Caspase 12、Bcl-2蛋白的表达量

2.3 各组心肌组织的病理形态学改变

光镜下sham组心肌细胞肌纤维排列整齐紧密，细胞形态结构正常，细胞核清晰可见；MI/RI组多数细胞肿胀，肌纤维断裂、缺损，细胞间质大量水肿并伴有大面积出血；低剂量组细胞出现轻微肿胀，胞内空泡增多，伴少量出血，但细胞核清晰可见，细胞膜完整；高剂量组肌纤维排列基本完整，细胞间质少量水肿肿胀，未见血管扩张，细胞结构相对完整(图2)。

图2 光镜下各组心肌病理学变化

2.4 各组心肌梗死面积比较

sham组未见明显缺血区，其余3组间心肌缺血范围差异无统计学意义(P>0.05)。与MI/RI组比较，低剂量和高剂量组的心肌梗死范围显著减少(P<0.01)，与低剂量组比较，高剂量组心肌梗死范围减少更显著(P<0.05；表3，图3)。

图3 各组心肌梗死面积的比较

表3 各组心肌梗死面积的比较

3 讨 论

GRP-78是内质网应激的标志性启动蛋白[6]。GRP-78在行使“代偿性”内质网应激保护作用的同时，其表达量会随内质网应激时间延长而减少。这可能是由于持续的内质网应激不仅使GRP-78表达增加，也激活了CHOP、JNK和Caspase 12等多个凋亡通路信号[7]。Caspase 12的激活是内质网应激唯一不依赖于其他通路独立诱导细胞凋亡的通路[8,9]。有实验表明，在输尿管梗阻早期，Lam可能通过上调内质网应激分子伴侣GRP-78、GRP-94蛋白表达，阻断内质网应激信号传导通路，从而减轻早期肾间质纤维化的发生和发展[10]。昆布多糖硫酸酯不仅能显著降低受损心肌细胞内氧自由基含量[11]，还能有效地清除氧自由基，减轻氧化损伤和治疗肺纤维化[12]。GRP-78的表达量反映MI/RI时内质网应激的程度，Caspase 12、Bcl-2的表达量反映心肌细胞凋亡的程度。本研究结果表明，与sham组比较，MI/RI组GRP-78、Caspase 12的表达增加，凋亡基因Bcl-2的表达减少，表明在MI/RI期间可能发生了由内质网应激介导的Caspase 12相关凋亡途径，并诱导了细胞凋亡；与MI/RI组比较，Lam低、高剂量组GRP-78、Caspase 12蛋白的表达减少，Bcl-2表达增加，可能与Lam预处理抑制内质网应激诱导的细胞凋亡、产生心肌保护作用有关。

HE染色和心肌梗死面积双染的观察能直接反映心肌组织损伤的程度。本实验结果表明，Lam处理组明显减轻心肌组织的损伤，高剂量组更显著，提示Lam预处理具有心肌保护作用，可能机制为Lam抑制GRP-78的过度表达，抑制了由内质网应激介导细胞凋亡途径的激活，下调了Caspase 12凋亡通路，增强了Bcl-2的表达，从而减轻了心肌细胞凋亡。

昆布在食物及药材中广泛存在，但Lam提取、分离、提纯等过程尤为复杂且成本较高，目前如何提取Lam仍是食品生物工程等学科的研究热点。本实验表明，Lam可通过抑制由内质网应激介导的心肌细胞凋亡途径，对心肌产生保护作用。但由于MI/RI的发病机制由多个通路共同作用，相互联系，具体机制目前还无明确定论。本实验仅从内质网应激角度出发，探讨Lam是否与细胞凋亡有关，因而相对具有局限性，具体机制还有待进一步实验验证讨论。