基于rDNA-ITS序列的甘肃甘南野生羊肚菌遗传多样性分析

王龙 周庆平 刘建明

摘要：通过对采自甘肃甘南藏区的16株野生羊肚菌菌株进行分子生物学分析，对rDNA基因内转录间隔区（ITS）片段进行PCR扩增并测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对，鉴定得知，16株供试羊肚菌共归纳为5种，分别为黑脉羊肚菌（Morchella angusticeps）、羊肚菌（Morchella esculenta）、高羊肚菌（Morchella elata）、粗腿羊肚菌（Morchella crapssipes）和尖顶羊肚菌（Morchella conica）。根据采用最大简约法（MP）和邻接法（NJ）构建的分子进化树得知，2种分子进化树拓扑结构相似，并且Bootstrap验证显示，系统发育树各分支都有很高的支持率，说明其系统关系有很高的可信度。结果可为该地区羊肚菌（Morchella spp.）的系统分类提供较为准确的分子性状依据。

关键词：rDNA-ITS;羊肚菌;序列分析;甘肃甘南

中图分类号： S646.701  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0081-04

羊肚菌（Morchella spp.）是羊肚菌科羊肚菌属所有种类的总称，是一类经济价值很高的珍稀野生食（药）用真菌，具有较高的营养价值和药用价值[1]。据有关资料显示，羊肚菌含有多种生理活性物质，尤其是蛋白质含量极为丰富，同时还含有人体必需的各类氨基酸、维生素和铁、锌等多种矿质元素[2-3]。在羊肚菌的分类学研究中，由于其形态特征具有很大的可塑性和人为性，给分类研究工作带来很多困难，单纯依靠传统形态分类方法很难解决羊肚菌的系统学问题，分子生物学的飞速发展为从分子水平解决羊肚菌的系统学问题提供了新的技术方法和研究平台[4-6]。针对我国羊肚菌主产地之一的甘肃甘南藏区，到目前为止，除20世纪80年代有学者开展过有关当地羊肚菌资源学方面的研究报道外[7-8]，至今鲜见有关该地区羊肚菌分子系统学方面的研究。鉴于上述问题，本研究试图从传统形态分类学以及分子系统学角度来探讨甘肃甘南境内野生羊肚菌的系统发育关系。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株为2017年4—5月在甘肃甘南境内的迭部县、舟曲县收集到的野生羊肚菌菌株。供试菌株总共16株，结合《中国大型真菌原色图鉴》[9]对菌株进行鉴定并分别编号为GN-M1、GN-M2、GN-M3、GN-M4、GN-M6、GN-M9、GN-M10、GN-M12、GN-M14、GN-M17、GN-M19、GN-M22、GN-M25、GN-M27、GN-M31、GN-M32（图1）。

1.2 主要试剂

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）裂解缓冲液（pH值为8.0，美国Genview公司）;2×PCRmix（上海时代生物科技有限公司）;DL2000 DNA marker（日本Takara公司）;琼脂糖（上海艾研生物科技有限公司）;EDTA（乙二胺四乙酸）、氯仿、异戊醇、无水乙醇、盐酸、乙酸钠、氯化钠、Tris（三羟甲基氨基甲烷）均為国产分析纯。扩增ITS片段（内转录间隔区）所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体为上游引物ITSl：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.3 总DNA提取

取供试菌株羊肚菌子实体的菌盖部分，参照白永宏等的研究方法[10]，经多次改进、验证，探索出适合本试验的DNA提取技术。（1）称取浸泡、冲洗、消毒后的羊肚菌子实体菌盖约0.5 g，切碎置于无菌预冷的研钵中，加入适量液氮，研磨至粉末状。（2）迅速将其转入2 mL离心管中，加入1.5 mL预热至65 ℃的CTAB（pH值为8.0）裂解缓冲液，缓慢颠倒混匀后，置于65 ℃下水浴1.5 h，每隔10 min颠倒混匀1次。（3）在 12 000 r/min 下离心15 min，将上清液移至新的离心管中。（4）加入等体积的苯酚和氯仿，缓慢摇匀，在 12 000 r/min 下离心10 min，将上清液移至新的离心管中。（5）加入等体积的氯仿和异戊醇，缓慢摇匀，在12 000 r/min下离心 10 min，将上清液移至新的离心管中。（6）加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，在-20 ℃下静置3.0 h后在12 000 r/min 下离心 10 min，弃去上清液，留DNA沉淀。（7）用75%乙醇洗涤DNA沉淀2次，弃去上清液。（8）离心、真空抽干得到DNA，每管加入适量无菌水溶解沉淀DNA，在-20 ℃下低温保存备用。

1.4 PCR扩增

1.4.1 PCR扩增反应体系 PCR扩增反应体系为50 μL，含10×PCR buffer 5.0 μL;dNTPs 1.0 μL;模板DNA 1.0 μL;ITS1 1.0 μL;ITS4 1.0 μL;Taq聚合酶1.0 μL;双蒸水40.0 μL。

1.4.2 PCR扩增程序 PCR扩增程序为94 ℃预变性2 min;94 ℃变性40 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸100 s，35个循环;72 ℃延伸10 min，终止温度为 4 ℃。采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测ITS-PCR扩增产物，用凝胶成像系统拍照并记录电泳谱带。

1.5 ITS片段测序

PCR扩增产物经电泳检测后，使用上海基康生物技术有限公司提供的UNIQ-10柱式DNA回收试剂盒进行回收和纯化，并将样品报送上海基康生物技术有限公司进行测序。将获得的菌株序列结果在GenBank上进行BLAST分析，利用软件CLUSTALX 1.81删除缺失位点和残缺位点，然后进行同源性比较，最后用软件MEGA 6.06通过最大简约法（maximum parsimony，MP）和邻位相连法（neighbour joining，NJ）分别构建分子系统发育树，明确供试菌株的种属及分类地位[11-13]。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

16株野生羊肚菌ITS片段PCR扩增结果见图2。

2.2 ITS序列测序及BLAST比对分析

本试验中的16株羊肚菌标本所测得的ITS序列长度和GC含量见表1。登陆Genbank数据库，将所测得的序列进行BLASTN比对分析。结果发现，GN-M1、GN-M2、GN-M6和GN-M10的核苷酸序列与登录号为JQ691485、DQ257338、AJ698476、JX069625的黑脉羊肚菌（Morchella angusticeps）ITS序列相似度达99%;GN-M3、GN-M4、GN-M9和GN-M12与登录号：U51851、AJ543741的羊肚菌（Morchella esculenta）ITS序列相似度达99%;GN-M14、GN-M22、GN-M17和GN-M19与登录号为GQ249378、GQ249383、EU83482的高羊肚菌（Morchella elata）ITS序列相似度达97%～98%;GN-M25和GN-M31与登录号为EU701002的粗腿羊肚菌（Morchella crassipes）ITS序列相似度达99%;GN-M27和GN-M32与登录号：AM269501的尖顶羊肚菌（Morchella conica）ITS序列相似性达97%～98%。

2.3 基于ITS序列系统树的构建

为了更好地探讨甘肃甘南藏区野生羊肚菌的系统发育关系，从GenBank数据库下载了与本研究相关的羊肚菌科钟菌属（Verpa）的3个ITS序列（登录号分别为GU551670、GU551672、JN043311）以及羊肚菌属中的普通羊肚菌（Morchella vulgaris）、小海绵羊肚菌（Morchella spongiola）、半开羊肚菌（Morchella semilibera）、变红羊肚菌（Morchella rufobrunnea）（登录号分别为AF000971、JQ691480、AF008233、DQ355921）的ITS序列，对其进行BLASTN比对分析后，分别采用邻接法（neighbour-joining，NJ）和最大简约法（maximum parsimony，MP）构建分子进化树，结果分别见图3和图4。

由图3和图4可以看出，NJ和MP这2种方法构建的系统发育树拓扑结构相似，并且Bootstrap验证显示，系统发育树各分支都有很高的支持率，说明系统关系的可信度高。结合测序结果分析，本试验中16株羊肚菌经分子鉴定最终归类为5种，分别为黑脉羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）、羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9、GN-M12）、高羊肚菌（GN-M14、GN-M22、GN-M17、GN-M19）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）和尖顶羊肚菌（GN-M27、GN-M32），这5种羊肚菌主要归类于黄羊肚菌类群（羊肚菌、粗腿羊肚菌）和黑羊肚菌类群（尖顶羊肚菌、黑脉羊肚菌、高羊肚菌）。

通过对系统发育树的分析发现，登录号为GU551670和GU551672的钟菌属（Verpa）的2个菌种聚为一支，但登陆号为JN043311的钟菌属（Verpa）的1个菌种却和羊肚菌聚为一类;登录号为AF000971的普通羊肚菌和登陆号为JQ691480的小海绵羊肚菌与羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9和GN-M12）、黑脉羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）亲缘关系较近，可以聚为一类;登录号为DQ355921的变红羊肚菌与尖顶羊肚菌（GN-M27、GN-M32）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）大体聚为一类;登录号为AF008233的半开羊肚菌与其他羊肚菌遗传距离较远，似乎可与钟菌属（Verpa）的2个菌种GU551670和GU551672聚为一类，究其原因还有待进一步深入研究。

3 结论

經分子生物学研究得知，16株供试羊肚菌菌株可归纳为5种，分别为黑脉羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）、羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9、GN-M12）、高羊肚菌（GN-M14、GN-M22、GN-M17、GN-M19）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）和尖顶羊肚菌（GN-M27、GN-M32），且这5种羊肚菌主要归类于黄羊肚菌类群（羊肚菌、粗腿羊肚菌）和黑羊肚菌类群（尖顶羊肚菌、黑脉羊肚菌、高羊肚菌）。通过分子进化树分析得知，利用最大简约法（MP）和邻接法（NJ）2种方法构建的系统发育树拓扑结构相似，并且Bootstrap验证显示，系统发育树各分支都有很高的支持率，说明其系统关系有很高的可信度，同时也说明本研究结果可为该地区羊肚菌的系统分类提供较为明确的分子性状依据。本研究中的羊肚菌经分子鉴定后的结果与依据形态学分类的结果有一定差异，分析原因可能是该地区羊肚菌子实体的形态变化多样，其菌种的形态特征和生理生化指标又受多种外界因素的影响，这对其进行形态学分类具有很大的限制性。至于当前甘肃甘南境内还分布有该属多少种羊肚菌，还有待今后全方位地采集更多新鲜样品进行分离鉴定。此项工作的开展不但可以丰富该地区羊肚菌多样性分析的菌种资源库资料，还可为当地羊肚菌的人工栽培及其今后的开发利用提供科学理论与依据。

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