HIV/AIDS患者抗反转录治疗前后外周血单个核细胞中HIV-DNA检测临床意义

刘 苑 潘克女 张永乐 徐爱芳 郁文燕

艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),是一种由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的致死率较高的感染性疾病，已成为全球范围内公共卫生问题和社会问题[1]。联合国艾滋病规划署2018年报道，2017年全球有约3690万人感染艾滋病病毒(HIV)，其中180万人为新感染HIV，较2001年新发感染约340万例相比下降47%[2]。这与近年来HIV病毒感染的早期诊断和抗反转录治疗(antiretroviral therapy，ART)密切相关[3,4]。ART是目前对抗HIV感染的主要手段，然而停药后病毒再次复制，体内HIV-RNA病毒载量迅速反弹,近年来研究者认为HIV病毒与宿主细胞基因组以整合和非整合的形式存在，这些以DNA分子存在的HIV“病毒储存库”直接决定了病毒能否被彻底清除，也与患者病程进展相关[5]。为了解HIV/AIDS患者ART前后外周血单个核细胞中HIV-DNA载量的变化，对50例HIV/AIDS患者ART前和ART 48周时HIV1型病毒感染者进行HIV1-DNA、HIV1-RNA以及CD4+淋巴计数进行了检测，结果报道如下。

材料与方法

1.研究对象:2017年1月～2018年12月在杭州市西溪医院就诊的艾滋病感染者50例患者在本次就诊前均未采用抗病毒或免疫调节治疗。HIV1感染诊疗标准参照中华医学会感染病分会AIDS学组2018年版的AIDS诊疗指南[6]，50例采用ART的患者中男性35例，女性15例，患者年龄20～50岁，患者平均年龄33.5岁，用药方案：齐多夫定(AZT)0.3g口服，2次/天；拉米夫定(3TC)：0.3g口服，1次/天；司他夫定(D4T)：30mg口服，2次/天；奈韦拉平(NVP)：0.2g口服，1次/天；依非伟伦(EFV)：600mg口服，1次/天。接受AZT+3TC+NVP治疗的患者35例，接受D4T+3TC+NVP治疗的患者6例，接受AZT+3TC+EFV治疗的患者6例,3例患者接受D4T+3TC+EFV治疗；所有病例均经杭州市疾病预防中心确诊为HIV1感染。受试者采血前签署知情同意书，且研究已获杭州市西溪医院医学伦理学委员会批准。

2.仪器和试剂：美国AB7500型实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorf冷冻离心机，上海精宏产恒温水浴锅，德国Eppendorf移液器。美国贝克曼库尔特FC500流式细胞仪。广州中山大学达安基因股份有限公司生产HIV1-RNA实时荧光定量检测试剂盒(检出下限为50IU/ml)，美国贝克曼库尔特公司生产T淋巴细胞亚群分类检测试剂，HIV1-DNA试剂盒为本实验室自建方法，检出下限为50copies/106PBMC，引物探针委托上海生工生物科技有限公司合成纯化,引物探针详见表1，其他原料购自广州蓝博生物技术公司。

表1 HIV1-DNA TaqMan-MGB荧光探针PCR的引物与探针

3.HIV1-DNA病毒载量检测反应体系配比及反应条件：采用实验室构建的反应体系PCR mix 12μl(Buffer, Mg2+, dNTP),1.5UTaq酶1μl, 0.5μmol/L的上游引物、下有引物各0.5μl，0.1μmol/L的荧光探针1μl, ddH2O 8μl,模板2μl合计25μl。扩增程序为: 激活UNG酶37℃ 5min,预变性95℃ 5min,扩增95℃ 15s，58℃ 45s运行55个循环。

4.标本采集和处理:采集HIV感染者抗病毒治疗前和抗病毒治疗48周时的外周血，其中非抗凝血1支约3ml,EDTA抗凝血2支，每支约2ml。非抗凝血分离血清，取1ml血清编号后-70℃保存用于HIV1-RNA检测。EDTA抗凝血1支采用流式细胞技术进行T细胞亚群检测。另一只EDTA抗凝血分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),得到PBMC后采用缓冲液溶解并在显微镜下计数总细胞数。将得到的PBMC溶液稀释到1×106个/毫升编号后-70℃保存用于HIV1-DNA检测。

结 果

1.50例HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-DNA变化:50例HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-DNA检出率均为100%，但HIV1-DNA含量ART前为3.29(2.41,3.72)高于ART 48周时含量2.76(1.98,3.28)Lgcopies/106PBMC，差异有统计学意义(Z=-6.758,P<0.01)，详见图1。

图1 HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-DNA变化

2.50例HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-RNA变化以及与HIV1-DNA相关性：50例HIV/AIDS患者ART前外周血HIV1-RNA含量4.28(4.05，4.95)LgIU/ml,HIV1-DNA检出率100%,含量3.29(2.41，3.72)Lgcopies/106PBMC。ART 48周时外周血HIV1-RNA均<1.70LgIU/ml(50IU/ml)，HIV1-DNA检出率仍为100%，含量2.76(1.98，3.28)Lgcopies/106PBMC。50例HIV/AIDS患者ART前后HIV1-DNA与HIV1-RNA含量呈正相关(r=0.627,0.415,P均<0.01)，详见图2。

图2 HIV/AIDS患者ART前后外周血HIV1-RNA与HIV1-DNA相关性

3.50例HIV/AIDS患者ART前后外周血T淋巴计数比较：50例HIV/AIDS患者ART前外周血T淋巴细胞CD4+计数及CD4+/CD8+值明显低于ART后，差异有统计学意义(t=5.728,6.254,P<0.01),ART后CD8+有所降低但与ART前比较，差异无统计学意义(t=-0.209,P>0.05)，详见表1。

表1 HIV/AIDS患者ART前后外周血T淋巴计数比较

4.50例HIV/AIDS患者ART前及后外周血CD4+T淋巴细胞计数与HIV1-DNA含量相关性:50例HIV/AIDS患者ART前及后外周血CD4+计数与HIV1-DNA含量呈负相关(r=-0.396,P<0.05),详见图3。

图3 HIV/AIDS患者ART前后外周血CD4+T淋巴细胞计数与HIV1-DNA含量相关性

讨 论

抗反转录治疗(ART)是目前抑制HIV/AIDS患者体内病毒复制的主要手段，ART抑制HIV-RNA病毒复制，提高外周血T淋巴细胞CD4+数量，改善患者免疫系统，减少因免疫损伤引起的多种机会性病毒感染的主要途径，然而停药后病毒反弹就是因为“储存库”中的DNA分子转录出病毒基因RNA和信使RNA，合成的病毒蛋白质在蛋白酶的作用下产生成熟的HIV颗粒从细胞表面释放出来，感染其他CD4+T淋巴细胞。研究者认为，抗病毒治疗停药时机体HIV-DNA含量高低对预测病毒反弹时间具有相关性，高HIV-DNA含量患者停药后反弹的速度更快[7，8]。因此病毒库持续存在成为HIV/AIDS患者彻底治愈的最大障碍。

目前对HIV1-DNA含量检测主要采用实时荧光定量PCR技术[9～11]。本研究采用TaqMan-MGB荧光探针技术对50例HIV/AIDS患者ART前和ART 48周时外周血HIV1-DNA含量，HIV1-RNA含量，T淋巴计数进行分析。在ART治疗前后外周血PBMC中均能检出HIV1-DNA，但是ART前HIV1-DNA含量显著高于ART 48周时，这一结论与陈伟烈等研究结论一致[12]。目前的ART不能清除HIV1-DNA,相关文献还表明HIV/AIDS患者外周血DNA储存库的大小与ART方案无相关性。本研究ART方案病例分配不均未能进行不同ART方案间进行比较。从HIV1-DNA含量分析在ART前50份标本HIV1-DNA含量中位数为3.29Lgcopies/106PBMC高于何惠达等报道的3.08Lgcopies/106PBMC(1207.95copies/106PBMC),差别主要来源于检测标本类型[13]。

本实验检测外周血PBMC中的HIV1-DNA总含量，而何惠达等研究是CD4+T淋巴中的含量,因此结果较笔者的数值要低。HIV1-RNA含量在ART前中位数为4.28LgIU/ml，而ART 48周时50例患者HIV1-RNA均<1.70LgIU/ml(50IU/ml)的最低检出限。郑煜煌等[14]对艾滋病ART 0、24、48周的HIV1-RNA报道显示,ART 0周时平均含量为4.12LgIU/ml，24周时全部<1.70LgIU/ml，与笔者的研究结果极为相似。HIV/AIDS患者ART过程中T淋巴细胞计数检测是最常用的手段，尤其以CD4+细胞计数的改变已成为判断ART疗效的重要指标之一，随着ART进程CD4+细胞计数逐渐升高，在ART 48周时很多患者CD4+细胞计数达到正常，而另一指标CD8+细胞计数在整个ART过程中变化不明显，从而使CD4+/CD8+比值也随着CD4+细胞计数的升高而升高。

本研究对ART前后HIV1-DNA与HIV1-RNA含量做相关性分析发现HIV1-DNA与HIV1-RNA呈正相关，且治疗前HIV1-DNA与HIV1-RNA含量相关性优于抗病毒治疗48周，这与抗病毒治疗48周时HIV1-RNA均低于50IU/ml(1.70LgIU/ml)相关。结论与陈伟烈等[12]研究略存在差异。陈伟烈等研究将治疗前治疗后数据统一分析，因此总的相关性降低，并且HIV1-RNA<1.70LgIU/ml的结果视为0，这也是降低正相关的另一原因。ART前后HIV1-DNA与CD4+细胞计数做相关性分析发现，与CD4+细胞计数呈负相关，结果与陈伟烈等[12]研究结论一致。因此接受ART的HIV/AIDS患者当HIV1-RNA减少到低于检出限时，外周血PBMC中仍能检出HIV1-DNA，这可能是HIV感染者ART停药后病毒重新复制的主要原因。