冬凌草对高糖-高脂诱导的非酒精性脂肪性肝病大鼠模型线粒体功能及氧化应激的影响

成伯宁，刘殿雷，史婷婷，田芳，金剑虹

(1.浙江杭州市中医院，a内分泌科，b外科，杭州 310007；2.浙江杭州市西溪医院肝病科)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为全球常见的慢性肝病之一[1]。Tateishi等[2]研究表明：NAFLD主要包括：单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌。NASH 是继慢性病毒性肝炎和酒精性肝炎后，肝纤维化的又一大成因。数据显示： NASH患者在3至4 年内发生肝纤维化[3]。肝纤维化(LF)是对各种肝损伤的创伤愈合反应，其病理过程特征主要是以细胞外基质生成和降解失衡，造成大量细胞外基质在肝内沉积造成的[4]。目前治疗NAFLD的药物不多，大多数药物具有一定的副作用，冬凌草是一种中药，研究表明冬凌草具有清热解毒、抗肿瘤、保肝降酶的作用[5]。但目前关于冬凌草对NAFLD的作用机制尚不完全统一。本文旨在探究冬凌草对高糖-高脂诱导的NAFLD大鼠模型线粒体功能及氧化应激的影响，为NAFLD的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级3周龄SD大鼠60只，购自广东医学院实验动物中心(粤监证字 2018A029号)，饲养温度20～25 ℃，相对湿度50%～65%，该实验经过杭州市中医院动物伦理委员会批准同意，本实验严格遵循动物实验3-R原则。

1.2 药物与试剂 大鼠饲料购自西南医科大学实验动物中心；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒均购自上海恒远生物科技有限公司；中性甲醛、酒精、二甲苯购自天津科密欧有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒(货号：C2006)购自碧云天有限公司。

1.3 仪器 Sysmex-chemix-180 型全自动生化分析仪购自日本 Furuno Electric公司；BS-124s 型电子天平购自北京赛多斯仪器系统有限公司；TGL-16M低温离心机购自济南来宝医疗器械有限公司；3-5w低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司；SG-51正置型金相显微镜购自上海光学仪器厂；LD-66实验室切片机购自长沙益广制药机械公司；UV-1800双光束紫外可见分光光度购自上海美析仪器有限公司。

1.4 分组及建立模型方法 将60只大鼠适应性喂养1周，随机选15只为对照组，其余45只大鼠采用高脂饲料喂养制成非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，制作方法及判断模型是否成功参考宓伟等[6]研究。具体操作如下：空白组予以普通饲料喂养，实验组(模型组、低剂量冬凌草组、高剂量冬凌草组)予以等重量高脂饲料喂养，两组均自由饮水。其中高糖-高脂饲料在普通饲料的基础上加16%猪油、10%蔗糖、2%胆固醇、2%猪胆盐，3周后禁食12 h后，眼球取血，分离血清，全自动生化分析仪测定胆固醇、三酰甘油水平，大鼠处死后迅速开腹，观察肝脏形态，实验组大鼠肝细胞明显肿胀，肝组织内可见弥漫分布的大脂滴及微脂滴，并散布全肝，则认为非酒精性脂肪性肝病大鼠建模成功，空白组大鼠均存活，存活率100%，造模的45只大鼠死亡6只，存活率86.7%，剩余39只平均分到各组，每组13只。

1.5 药物干预 参考宋琪雯等[7]使用的冬凌草剂量，本研究低剂量冬凌草组和高剂量冬凌草组使用分别使用4 g·kg-1·d-1和8 g·kg-1·d-1的冬凌草灌胃治疗3周，对照组和模型组采用等剂量的0.9%氯化钠注射溶液灌胃，所有大鼠均处理3周。

1.6 检测项目

1.6.1 大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、r-谷氨酸转移酶(GGT)测定 处死大鼠并眼球取血0.1 mL，分离血清，各按照全自动生化检测仪使用方法检测大鼠血清LT、AST、GGT含量变化。

1.6.2 大鼠线粒体功能检测 剪碎大鼠肝脏组织置于匀浆器内匀浆，研磨后转移到离心管内，在4 ℃恒温下，以3 700 r/min，离心5 min，取沉淀使用超声破碎仪破碎线粒体并加入倒入1.5 mL裂解液，配制双缩脲试剂、制作标准曲线及测定线粒体含量均按试剂盒要求进行。

取上述大鼠肝脏制成的线粒体悬浮液，应用紫外光光度法测定细胞色素氧化酶活性，用分光光度计在350 nm处测定其吸光度。根据标准液求得的回归方程，计算出被过氧化氢氧化生成的碘量，根据空白与测试样品两者之差，计算出过氧化氢酶的活性。

取上述大鼠肝脏制成的线粒体悬浮液，采用试剂盒测线粒体膜电位具体操作方法严格按照试剂盒说明书操作。

1.6.3 大鼠血清氧化应激物质含量检测 剪碎大鼠肝脏组织置于匀浆器内匀浆，研磨后转移到离心管内，在4 ℃恒温下，以3 700 r/min，离心5 min，取沉淀使用超声破碎仪破碎线粒体并加入倒入1.5 mL裂解液，使用MDA、SOD、LDH试剂盒子，严格按照试剂盒操作进行检查其水平。

2 结果

2.1 大鼠肝功能检测结果 检测大鼠肝功能指标看出，相比空白组，模型组大鼠ALT、AST、GGT水平显著升高(P<0.05)；相比模型组，使用冬凌草处理各组大鼠ALT、AST、GGT水平显著降低，且高剂量冬凌草组大鼠ALT、AST、GGT显著低于低剂量冬凌草组(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠肝功能检测结果

2.2 大鼠线粒体功能检测结果 检测大鼠肝脏线粒体相关指标发现，相比空白组，模型组大鼠线粒体含量、细胞色素C氧化酶活性、线粒体膜电位差显著降低(P<0.05)；相比模型组，使用冬凌草处理各组大鼠线粒体含量、细胞色素C氧化酶活性、线粒体膜电位差显著升高，且高剂量冬凌草组大鼠线粒体含量、细胞色素C氧化酶活性、线粒体膜电位差显著高于低剂量冬凌草组(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠线粒体功能检测结果

2.3 大鼠血清氧化应激检测结果 检测大鼠血清内氧化应激物质含量结果显示，相比空白组，模型组大鼠MDA、LDH含量水平显著升高，SOD含量水平显著降低(P<0.05)；相比模型组，使用冬凌草处理各组大鼠MDA、LDH含量水平显著降低，且高剂量冬凌草组大鼠MDA、LDH含量水平显著低于低剂量组(P<0.05)；相比模型组，使用冬凌草处理各组大鼠SOD含量水平显著升高，且高剂量冬凌草组大鼠SOD含量水平显著高于低剂量组(P<0.05)，见表3。

表3 大鼠血清氧化应激检测结果

3 讨论

血清ALT、AST活力的大小是检验肝脏损伤的重要指标之一[8]。当肝细胞发生酒精性损伤后，细胞破裂，胞浆中的 ALT 和 AST 会释放进入血液循环，造成血清中转氨酶含量升高。血清ALT、AST及GGT活力的大小直接反映了肝细胞受损的程度[9]。本研究发现，相比模型组，使用冬凌草处理各组大鼠体质量显著降低且ALT、AST、GGT水平显著降低。说明冬凌草可以有效缓解非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏受损程度，这可能是因为冬凌草的主要化学成分是贝壳杉烯类二萜，具有降低炎性反应的效果，同时可以保护肝脏细胞，防止细胞破损而造成ALT和AST进入血液循环。姚会枝[10]研究表明：冬凌草的主要成分烯类二萜可以有效降低血清中ALT和AST含量水平。本研究得出的结论与其一致。

线粒体是全身能量代谢的中心，一旦肝脏中的线粒体功能出现了异常，对肝脏的功能影响较大[11-12]。细胞色素C氧化酶是线粒体氧化能力的关键调节部位，在能量产生中起主要作用。本研究发现，使用冬凌草处理各组大鼠肝脏线粒体含量、细胞色素C氧化酶活性、线粒体膜电位差显著升高。说明冬凌草可以有效保护线粒体，通过保护线粒体维持肝脏正常功能。姬爱冬等[13]研究表明：提高大鼠肝脏线粒体含量、细胞色素C氧化酶活性、线粒体膜电位差可以有效缓解非酒精性脂肪肝的损伤。本研究得出的结论与其一致。

MDA会引发脂质过氧化反应，细胞内氧化程度越高，MDA含量水平越高，SOD具有抗氧化性，是经典的抗氧化酶之一，可以有效清除活性氧。机体内SOD水平越高说明机体清除活性氧的能力越强，当脑组织损伤时，其含量会显著降低[14]。本研究发现，相比模型组，使用冬凌草处理各组大鼠SOD含量水平显著升高。说明冬凌草可以缓解氧化应激反应，这可能是因为冬凌草的主要活性成分是冬凌草甲素，具有抗氧化性。吴岚等[15]研究表明：冬凌草可以通过抑制氧化应激反应治疗非酒精性脂肪肝。本研究得出的结论与其相一致。

综上所述，冬凌草通过保护线粒体功能并抑制氧化应激反应治疗非酒精性脂肪性肝病，在一定浓度范围内呈剂量依赖性，但本实验涉及到的样本量较少，在后续的实验中将进一步扩大样本量进行研究。