电子束辐照对海滨木槿和木槿种子的诱变效应分析

张春英,张 杰,龚 睿

(上海植物园,上海城市植物资源开发应用工程技术研究中心,上海200231)

海滨木槿(Hibiscus hamabo)和木槿(H.syriacus)为锦葵科木槿属落叶灌木[1-2]。 海滨木槿分布于浙江舟山、宁波等沿海一线海塘(堤),是一种极耐盐碱和干旱瘠薄、耐海潮间歇性淹没和海浪溅泼、抗风性特强的木本花卉和海岸基干林带、盐碱地绿化造林树种[3]。 木槿分布广泛,具有花期长、抗性强、容易养护等优点,是国内外园林中重要的夏花灌木之一[2]。 该两种木槿属植物因其优良特性在绿化中广泛应用,相关研究也日益受到关注,主要集中在形态和生物学特性、光合特性、盐及水胁迫抗逆等方面[4-5],但其育种相关研究报道很少,仅见李秀芬等[6]和李玉萍等[7-8]相关研究。 海滨木槿目前仅发现原种,未见种下变异,均为黄色单瓣花[9],花色单一,且开花比较稀疏,观赏价值有待提高。 木槿花色丰富,耐寒性强,但是株型比较单一,抗病虫害能力也有待提高。 木槿属内种间杂交存在生殖隔离,杂交亲和率低[7],通过种间杂交扩大变异谱,获得优良变异单株筛选新品种的难度较大。 因此,如何诱发较高的变异率是海滨木槿和木槿新品种培育的关键技术。

电子束辐照技术即利用电子加速器产生的低能或高能电子束,辐照作用对象,使之发生常规方法难以引发的物理、化学及生物学反应,从而使其品质或性状得以改善或保持[10]。 电子束辐照技术同广泛应用的60Co-γ 射线一样可用于农作物、花卉、林木等进行诱变育种。 而且,相比于60Co-γ 射线,电子束辐照诱变具有安全性好、射线利用率高、辐射损伤低、诱发变异频率高、变异谱广等优点,是一种高效的植物育种技术[11-12],可为观赏植物新品种选育提供多方向和广泛变异。 目前,已利用电子束辐照技术成功诱变选育了水稻、小麦、大麦、高粱、枸杞等多个禾谷类作物或经济作物品种[12],而且也开展了深入的机理研究[13-14]。 相对而言,电子束辐照诱变在观赏植物诱变中应用较少,尚未见在木槿属植物诱变育种方面的报道。 本研究选择海滨木槿和木槿种内自然杂交干种子为材料,分析电子束辐照对其种子萌发及幼苗生长的影响,确定电子束辐照的合适剂量范围,研究幼苗变异的表现,以期为提高两种木槿属植物的种内变异率和获得优良种质提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

诱变的植物材料为海滨木槿和木槿种内自然杂交的当年成熟干种子。

1.2 试验方法

电子束照射采用上海市农业科学院的直线电子加速器产生的能量为10 MeV 的电子束,辐照剂量范围在200—500 Gy,设置200 Gy、250 Gy、300 Gy、350 Gy、400 Gy、450 Gy、500 Gy 7 个辐照梯度。 每个辐照剂量处理100 粒种子,5 次重复,共500 粒种子,并设置不辐照的对照。 种子辐照处理后于4 月份播种在育苗穴盘中,基质为草炭和珍珠岩按1∶1混合后充分浇水,播种后放置在普通的塑料大棚中,经常喷水保持基质湿润,定期调查种子发芽数量和幼苗生长状况。 种子播种后,每天观察萌发情况并记录发芽的日期、发芽数量,直到没有新的种子萌发为止,计算发芽率。 发芽完成后,查看幼苗叶片是否生长正常,有无异常叶片,幼苗生长稳定后统计每个处理的成苗数量,计算成苗率。

发芽率=(种子发芽数∕供试种子数) ×100%

成苗率=(成苗数量∕供试种子数) ×100%

当年11—12 月份测量幼苗生长指标。 株高用卷尺测量植物自地上基部到顶端生长点的高度;地径为离开地面上1 cm 处的茎杆直径,用游标卡尺测量;节间长为主干上2 个节之间的长度。

1.3 辐照半致死剂量的确定

根据海滨木槿在不同剂量下的成苗率,拟合直线回归方程Y=a+bX,导出成活率为50%(LD50)对应的辐射剂量,以此作为确定海滨木槿种子辐照的最佳剂量范围的依据[15]。

2 结果与分析

2.1 电子束辐照对种子发芽和成苗率的影响

2.1.1 对海滨木槿种子发芽和成苗率的影响

电子束辐照对海滨木槿种子发芽率、始发芽时间及发芽完成时间均有显著影响(表1)。 辐照显著降低了种子的发芽率,但是随辐照剂量增加发芽率降低的趋势不明显。 7 个辐照组中,250 Gy 和350 Gy 辐照组的发芽率与对照组无显著差异,其余辐照组的发芽率均显著低于对照组,500 Gy 辐照组发芽率最低,比对照组低64%,且显著低于其他辐照组发芽率。 始发芽时间在辐照后有延迟的趋势,250—400 Gy 剂量辐照组始发芽时间均比对照组晚,但无显著差异,450 Gy 和500 Gy 辐照组始发芽时间显著晚于对照组,比对照组晚2—3 d。 所有处理的发芽完成天数均在22—24 d,对照组为23 d,无显著差异。

辐照组种子发芽后,部分幼苗根系发育异常,逐步死亡,成苗率显著下降(表1)。 随着辐照剂量的升高,成苗率急剧下降,均显著低于对照组,较低剂量(200 Gy 与250 Gy)辐照组的成苗率较高,分别为56.2%和63.8%,300 Gy 辐照组下降至26.6%,350 Gy 辐照组为7.2%,400 Gy 辐照剂量以上成苗率不足2%,500 Gy 辐照组的幼苗均发育不良,最后全部死亡。 根据成苗率,导出拟合线形方程Y=106.6 -0.232X,由此计算出成苗率50%(半致死剂量LD50)的辐照剂量为243.97 Gy。

部分辐照处理的幼苗在生长过程中,第1—3 片真叶出现扭曲、皱缩、缺刻等变异现象,主要出现在剂量较低的200—300 Gy 辐照组,变异率在23%—58%,变异率最大的是辐照剂量最低的200 Gy 组,显著高于对照组及其他处理组,其他高剂量辐照组变异率很低或未发现叶片变异现象,与对照组无显著差异。随着幼苗的生长,叶片逐渐转为正常。

表1 电子束辐照对海滨木槿种子发芽及成苗率的影响Table 1 Effects of electron beam irradiation on seed germination and seedling rate of Hibiscus hamabo

2.1.2 对木槿种子发芽的影响

电子束辐照对木槿种子的发芽率、始发芽天数和幼苗叶片的变异率均有显著影响(表2)。 在不同剂量辐照组处理中,除250 Gy 辐照组的发芽率与对照组无显著差异外,其他处理均显著低于对照组,辐照剂量在350—450 Gy 的发芽率较低,显著低于其他辐照处理的发芽率,其中450 Gy 辐照组的发芽率最低(24.8%),比对照组低48%。 在对始发芽天数的影响方面,低剂量(200 Gy 和250 Gy)辐照组始发芽天数显著缩短,比对照组约提前2 d,400 Gy 和500 Gy 高剂量辐照组显著延长,比对照组延迟约1.5 d。 发芽完成时间均为20—21 d,不同剂量辐照处理与对照组均无显著差异。

木槿幼苗成苗率随辐照剂量的增加显著降低,均显著低于对照组成苗率。 200 Gy 辐照组的成苗率为21.8%,比对照组低43.8%;250 Gy 辐照组为6.2%,300 Gy 辐照组为7.2%,350 Gy 辐照组为1.2%,其余3 个较高剂量辐照组成苗率均在1%以下。 根据木槿幼苗的成苗率,导出拟合线形方程Y=94.03 -0.218X,由此计算出成苗率50%(半致死剂量LD50)的辐照剂量为201.97 Gy。

不同剂量辐照组的木槿幼苗与海滨木槿类似,幼苗第1—3 片真叶出现扭曲、缺刻等不规则变异,低剂量辐照组叶片变异率显著提高,200 Gy 辐照组幼苗变异率最高,为32.4%,其次是300 Gy 辐照组(12.6%),其他辐照组的幼苗变异率均在10%以下,与对照组无显著差异。 随着幼苗的生长,叶片逐渐转为正常。

表2 不同剂量电子束辐照对木槿种子发芽情况及成苗率的影响Table 2 Effects of electron beam irradiation on seed germination and seedling rate of Hibiscus syriacus

2.2 电子束辐照对幼苗生长指标的影响

2.2.1 对海滨木槿幼苗生长的影响

海滨木槿最高剂量500 Gy 辐照组幼苗全部死亡,因此试验对辐照剂量200—450 Gy 辐照组幼苗生长数据进行分析。 根据生长指标统计,不同剂量电子束辐照显著影响了海滨木槿幼苗的生长,尤其是高剂量辐照显著降低了幼苗生长量(表3)。 幼苗株高在较低剂量辐照下显著增高或无显著差异,在高剂量辐照下显著降低,200 Gy 辐照组的幼苗株高显著高于对照组,比对照组高9%,250 Gy、300 Gy 辐照组的幼苗株高与对照组无显著差异;350 Gy、400 Gy 和450 Gy 辐照组的幼苗株高均显著低于对照组,比对照组低32%—44%,也显著低于200—300 Gy 辐照组的幼苗株高。 幼苗地径随着辐照剂量的增加逐步降低,所有辐照组的幼苗地径均显著小于对照组,350 Gy 剂量以上辐照组的幼苗地径显著低于200 Gy、250 Gy 辐照组,350 Gy 辐照组的幼苗地径最小,比对照组低41%。 幼苗节间长在较高剂量辐照组(350 Gy、400 Gy和450 Gy)显著降低,比对照组低30%—37%,较低剂量(200—300 Gy)辐照组的幼苗节间长与对照组无显著差异。

表3 电子束辐照对海滨木槿幼苗生长指标的影响Table 3 Effects of electron beam irradiation on seedling growth indexes of Hibiscus hamabo

2.2.2 对木槿幼苗生长的影响

各辐照处理组木槿均有一定数量正常生长的幼苗,在当年停止生长后,对幼苗的株高、地径和节间长进行测量和统计分析。 根据分析结果(表4),辐照对幼苗的3 个生长指标均有一定影响,幼苗株高除350 Gy 辐照组外,其余辐照组的幼苗株高均显著低于对照组,平均比对照组低19%—29%,但不同剂量的辐照处理间幼苗株高无显著差异;辐照处理后,幼苗地径有不同程度的降低,但仅有450 Gy 剂量组的地径显著低于对照组,比对照组低39%;辐照处理的幼苗节间长有不同程度的增加,但与对照组间均无显著差异。

表4 电子束辐照对木槿幼苗生长指标的影响Table 4 Effects of electron beam irradiation on seedling growth indexes of Hibiscus syriacus

3 结论与讨论

3.1 适宜的电子束辐照剂量

辐射诱变是通过增加变异率提高育种效率的一种育种手段,一定范围内辐照剂量可以提高植株的突变率和突变谱,但辐照剂量过高会导致植株存活率下降和不良突变增加,且不同的植株种类和生长状态材料对辐照的敏感性不同[6]。 半致死剂量是确定辐照敏感性的主要指标,也是确定适宜辐照剂量的重要参考[15]。 辐照后的成活率或成苗率是计算半致死剂量的主要依据[15]。 本研究利用成苗率计算半致死剂量(LD50),海滨木槿半致死剂量为243.97 Gy,木槿半致死剂量为201.97 Gy。 相关研究多以半致死剂量上、下相差20%作为产生更多有益突变的适宜辐照剂量[16]。 因此,本试验选用半致死剂量上、下相差20%的辐照剂量,确定海滨木槿干种子的电子束辐照适宜剂量为195.18—292.76 Gy,木槿干种子的辐照适宜剂量为161.58—242.36 Gy,木槿干种子比海滨木槿干种子对电子束辐照略微敏感一些。 植物种子半致死剂量同植物的种类、辐照能量、种子的辐照时期和辐照方法等都有一定的关系,因而半致死剂量随着上述条件的不同有一定变化[17]。

3.2 海滨木槿干种子辐照的诱变变异苗期效应

辐照对植物性状的影响在幼苗期主要表现在生长指标方面,唐菖蒲、盐角草、异子蓬和盐地碱蓬等在电子束辐照后均有幼苗生长发生显著变化,高剂量辐照抑制作用明显[15,18]。 本研究中两种木槿属植物在辐照后幼苗也表现类似现象。 海滨木槿在不同剂量电子束辐照后,幼苗株高、地径和节间长均在350 Gy剂量以上的辐照组显著降低,说明在高剂量的电子束辐照作用下海滨木槿的生长受到显著抑制;在较低剂量辐照处理中,3 个生长指标的表现出现了差异, 200 Gy 低剂量辐照处理显著增加了幼苗株高,200—300 Gy辐照处理显著降低了幼苗地径,而对幼苗节间长无显著影响。 木槿幼苗在辐照后株高显著降低,但是随辐照剂量增加生长量降低的趋势不明显,而地径及节间长均无显著变化。 以上结果表明,两种木槿辐照后幼苗的株高均出现显著差异,与玉米辐照后幼苗株高差异显著一致[19]。 李秀芬等[6]使用60Co-γ辐照木槿、海滨木槿,在50—250 Gy 剂量范围内幼苗的株高与对照没有显著差异。 可见,电子束辐照有可能使株高的变异几率更大,但是木槿、海滨木槿均为多年生木本植物,株高的差异能否在今后的生长中保持仍有待进一步观测。

电子束辐照后幼苗除在生长指标上有差异外,幼苗早期的真叶也出现一定比例的畸形叶,2 种木槿属植物均在第1—3 片真叶上出现扭曲、缺刻等现象,在低剂量辐照组畸形叶比例较高,剂量升高畸形叶比例降低甚至无畸形叶。 李秀芬等[6]使用60Co-γ 辐照时也发现类似的现象,但是叶片畸形比例较高且随着剂量的增加而升高。 此结果说明较低剂量(200—300 Gy)电子束辐照影响幼苗早期叶片的发育。 根据幼苗生长表现,两种木槿均在200—300 Gy 剂量下出现一定的差异,且成苗率较高,此剂量范围正好在本试验估算的适宜辐照剂量范围之内,说明该剂量范围的估算是合理的。