高效液相色谱法测定琥珀酸多西拉敏片中有关物质

乔乔，余小红，陈斌，晏飞，曹阳，黄顺旺，曹明成

琥珀酸多西拉敏是一种乙醇类抗组胺药，具有抗组胺作用、抗胆碱作用和显著的镇静作用，适用于多种过敏性鼻炎、过敏性皮肤病、枯草热、哮喘性支气管炎等，也可作为催眠药用于失眠的短期治疗［1-4］。1978 年 10 月美国食品药品监督管理局（FDA）批准CHATTEM 公司的琥珀酸多西拉敏25 mg片剂上市，用于帮助减轻入睡困难［5-9］。1979年琥珀酸多西拉敏成为OTC（非处方药）。琥珀酸多西拉敏作为辅助治疗睡眠的OTC抗组胺药物，临床安全有效，总体反应率高，耐受性好［10-14］，在国内尚未批准上市，因其疗效确切，服用方便，日益受到关注。

USP40标准［15］未对琥珀酸多西拉敏制剂有关物质进行控制，EP 9.0与BP 2016［16-17］只对原料药中杂质进行控制。另有文献报道了琥珀酸多西拉敏原料有关物质的检测方法［18-19］，对于制剂的有关物质检测方法尚未见文献报道。本研究于2017年10月至2018年9月，通过筛选和优化色谱条件，并参照中国药典（四部）收录的药品质量标准分析方法验证指导原则［20］，对已知杂质中杂质A、B、C、E、G进行了方法学验证研究。本方法可有效检出琥珀酸多西拉敏片中各已知杂质，实现了主峰与相邻杂质的良好分离。各已知杂质均为中间体或降解途径产生，其结构式如图1所示。

1 仪器与试药

岛津LC-20A高效液相色谱系统：岛津LC-20AT泵单元，岛津SPD-20A 紫外检测器，Labsolutions DB版色谱数据工作站。

图1 EP 9.0收录琥珀酸多西拉敏片中的已知杂质：A为N，N-二甲基-2-［1-苯基-1-（4-吡啶）乙氧基］乙胺、B为4-吡啶基苯基甲基甲醇、C为N，N-二甲基-2-［1-苯基-1-（2-吡啶）甲氧基］乙胺、E为N，N-二甲基-2-［1-苯基-1-（2-吡啶）乙氧基］乙胺氮氧化物、G为N-甲基-2-［1-苯基-1-（2-吡啶）乙氧基］乙胺

杂质A（批号20180302，纯度99.02%）、杂质B（批号 20180703，纯度 97.91%）、杂质 C（批号20180413，纯度98.12%）、杂质E（批号20180427，纯度99.38%）、杂质G（批号20180401，纯度99.76%）均为自制对照品；供试用制剂（批号20180801、20180802、20180803）为自制制剂；参比制剂（Unisom®，批号15110）来源于CHATTEM 公司；乙腈为色谱纯；水为超纯水；磷酸二氢钾、三乙胺、磷酸及其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备精密称取杂质A、B、C、E、G各适量，加流动相定量稀释制成每1 mL 含杂质A、B、C、E、G 各约为10µg 的混合溶液，作为混合对照品溶液。取琥珀酸多西拉敏与杂质A、B、C、E、G 对照品各适量，加流动相定量稀释制成每1 mL含琥珀酸多西拉敏约为2 mg、含杂质A、B、C、E、G 各约为10 µg的混合溶液，作为系统适用性溶液。取本品细粉适量（约相当于琥珀酸多西拉敏50 mg），精密称定，置25 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液0.5 mL 置100 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性以杂质A、B、C、E、G及主成分峰保留时间、主峰与相邻杂质峰的分离度为考察指标，对其色谱条件进行了筛选，试验方法及结果如下：色谱柱：苯基硅烷键合硅胶柱（如：Polar-Phenyl，250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：0.01 M磷酸二氢钾溶液（称取1.36 g 磷酸二氢钾，加水1 000 mL 溶解，加三乙胺溶液3 mL，用磷酸调节pH 至3.0）-乙腈（89∶11）；检测波长：262 nm，柱温：35 ℃，流速：1.0 mL/min，进样量：20 µL，记录至琥珀酸多西拉敏主峰保留时间的3倍。在选定的色谱条件下，琥珀酸多西拉敏峰保留时间适中，主成分峰与相邻杂质峰及杂质峰之间的分离度均达到要求。照“2.1”项下配制系统适用性溶液，精密量取20µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2所示。系统适用性溶液中，已知杂质A、B、C、E、G与琥珀酸多西拉敏峰分离度良好，专属性高。各杂质峰分离度均＞1.5，理论塔板数均大于2 000，符合系统适用性要求。

图2 琥珀酸多西拉敏与已知5种杂质系统适用性试验高效液相色谱图

2.3 专属性为了考察本分析方法对琥珀酸多西拉敏降解产物的分离情况，对其进行了破坏性试验。取琥珀酸多西拉敏片粉（批号20180801，约相当于琥珀酸多西拉敏50 mg），置25 mL量瓶中，分别加入1 mol/L盐酸溶液1 mL，1 mol/L氢氧化钠1 mL，室温放置15 d，调至中性，用流动相稀释至刻度，照“2.1”项下后续步骤即得酸、碱降解样品；取琥珀酸多西拉敏片粉（约相当于琥珀酸多西拉敏50 mg），置25 mL 量瓶中，分别加入30%过氧化氢溶液1 mL，室温放置1 d，用流动相稀释至刻度，照“2.1”项下后续步骤即得氧化降解样品；取琥珀酸多西拉敏片粉（约相当于琥珀酸多西拉敏50 mg），置25 mL量瓶中，80 ℃水浴放置15 d，用流动相稀释至刻度，照“2.1”项下后续步骤即得高温降解样品；取置光照度为（4 500±500）lx 的环境下放置15 d 的琥珀酸多西拉敏片粉（约相当于琥珀酸多西拉敏50 mg），置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，照“2.1”项下后续步骤即得光照降解样品。量取上述溶液各20µL，分别进样测定。

本品在酸、碱、光照条件下破坏后，琥珀酸多西拉敏的有关物质含量无明显增加；而经高温（80 ℃水浴，15 d）和30%过氧化氢（室温放置1 d）氧化破坏后，杂质含量明显增加，新增了一些极性较小、保留时间较长的杂质。各条件下色谱图见图3。说明琥珀酸多西拉敏片的生产及贮藏时应尽量避免高温环境，并进行密闭保存。

图3 琥珀酸多西拉敏专属性试验色谱图：A为未破坏，B为酸破坏，C为碱破坏，D为氧化破坏，E为高温破坏，F为光照破坏

2.4 定量限、检测限、线性范围分别称取琥珀酸多西拉敏对照品、杂质A、B、C、E、G 对照品适量，配制成含琥珀酸多西拉敏对照品、杂质A、B、C、E、G对照品约为0.5、1、2、5、10、20 µg/mL 的混合溶液。同时以信噪比（S/N）约为3 作为检测限；以信噪比（S/N）约为10 作为定量限。精密量取定量限浓度溶液及上述对照品溶液各20µL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析，结果见表1。

表1 琥珀酸多西拉敏与各已知杂质定量限、检测限与线性范围

结果表明：琥珀酸多西拉敏浓度在0.08～20.36µg/mL范围内，杂质A浓度0.08～20.14µg/mL，杂质B浓度0.05～19.85µg/mL，杂质C浓度0.10～20.66µg/mL，杂质E浓度0.25～20.39µg/mL，杂质G浓度0.05～22.63µg/mL，其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度与准确度精密度：按“2.1”项下方法制备供试品6 份，在“2.2”色谱条件下，以高效液相色谱仪进行测定，计算各杂质含量RSD。6 份样品中，超过报告限度（0.05%）的杂质含量RSD不大于10%，总杂RSD 不大于10%，本方法精密度良好。

准确度：精密量取混合对照品贮备液，加入供试品中，制成加入各已知杂质为限度的80%、100%、120%的回收率样品，进样分析，记录色谱图，计算各已知杂质回收率。杂质A、B、C、E 与G 的平均回收率依次为99.62%、98.87%、101.68%、102.85%和100.41%，RSD 依次为0.67%、0.76%、0.63%、0.62%和0.65%，本方法准确度良好。

2.6 溶液稳定性按“2.1”项下制备混合对照品溶液，25℃放置，并于0、2、4、6、8、12h分别取样进样分析，记录色谱图。混合对照品溶液12 h内杂质A、B、C、E、G 的峰面积RSD 分别为0.07%、0.09%、0.10%、0.12%和0.09%。供试品溶液12小时内，各杂质的峰面积RSD均不大于10%。表明混合对照品溶液与供试品溶液分别放置在室温条件下12 h内是稳定的。

2.7 耐用性通过分别调整色谱条件中的柱温（±2 ℃）、波长（±2 nm）、流速（±0.05 mL/min）及pH（±0.05）等来考察杂质与主成分之间分离度的影响及大于0.05%杂质含量变化。与正常条件比较，各条件下杂质检出个数一致，大于0.05%单杂、总杂含量RSD符合要求，表明本方法耐用性良好。

2.8 样品测定按上述已确定的色谱条件及方法，检查本品中试3批及参比制剂（Unisom®）1批样品的有关物质。结果见图4、表2。

图4 琥珀酸多西拉敏片剂中试三批样品与参与比制剂有关物质检测色谱图：A为批号20180801，B为批号20180802，C为批号20180803，D为参比制剂15110

表2 琥珀酸多西拉敏片有关物质检测结果（n=3）/%

3 讨论

色谱条件优化时，选择苯基硅烷键合硅胶柱，主峰与各杂质峰峰型良好，保留时间适宜；流动相水相中添加0.3%的三乙胺，可有效改善主峰与相邻杂质峰的分离度，并改善拖尾，故选用上述各条件并确定了最终的色谱条件。由检测结果可知，所测样品均能检出已知杂质或未知杂质，表明该分析方法能有效控制本品的有关物质，为琥珀酸多西拉敏片质量标准提供了试验依据。

因为国内外琥珀酸多西拉敏的生产工艺不尽相同，琥珀酸多西拉敏制剂的辅料及工艺也不同，所以应根据各国生产的实际情况制定相应的质量标准。本品用法用量为每次1 片，每日1 次。根据《化学药物杂质研究技术指导原则》附件2：制剂杂质限度，本品的鉴定限度为0.2%（最大日剂量＞10～2 g），质控限度为0.5%（最大日剂量＞10～100 mg）。根据小试、中试及工艺验证各3 批样品有关物质检查结果，初步拟定本品有关物质限度为：已知杂质A、B、C、E、G均≤0.5%，未知杂质≤0.2%，总杂≤3.0%。

本研究建立的琥珀酸多西拉敏片的有关物质检测方法快速简便、结果准确、重现性好，有利于药品质量控制。