草原龙胆花瓣花色素苷组成及与其花色的关系

高 嵩，李天来

（1.辽宁省经济作物研究所，辽宁 辽阳 111000；2.沈阳农业大学 园艺学院，沈阳 110161）

花色是观赏植物最重要的观赏性状之一[1]，花色素苷是花色形成的物质基础[2]，分析花瓣中色素的成分对于探讨花色形成的机理和分子育种都有重要的意义。目前，花瓣中色素含量和组分的研究已在菊花[3]、睡莲[4]、野百合[5]、风信子[6]、二月兰[7]等观赏植物中展开，而关于草原龙胆花色苷素在花瓣中的组成和含量尚未见报道。草原龙胆[Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners]又名洋桔梗，是龙胆科草原龙胆属宿根花卉，原产北美洲，一、二年草本植物。因其花色丰富，花型典雅，是鲜切花市场上的新兴花卉[8]。目前，草原龙胆的研究多数集中在种质遗传多样性[9]、栽培技术[10]、花药离体培养[11]、切花保鲜[8]、表型特征和生长特性[12]以及高温诱导莲座化分析[13]等方面。草原龙胆花色繁多，是研究花色合成途径的良好材料，关于花色素合成途径调控基因功能的研究已经展开[14-17]，而草原龙胆花瓣中花色素苷的类型和数量目前仍不清楚。

本研究通过对花色描述、特征颜色反应及UPLC-Q-TOF-MS 技术对草原龙胆12 个品系的花色、花色素类型及其花瓣中的花色素含量、花色苷组分进行定性和定量分析，旨在草原龙胆色素的纯化、分离、鉴定等工作奠定基础。运用线性回归方法分析CIE L*a*b*系统中不同色彩描述值与花色素苷的相关关系，简单探讨花色素苷含量与花色的关系，为深入阐明花色形成的生化途径和开展草原龙胆花色的改良育种等研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试草原龙胆 12 个自育品系为 Pink02、Pink Flash02、Apricot07、Carmine03、Misty Blue01、Lavender04、Purple07、Blue01、Brown01、Yellow06、Yellow02 和 White13，其花瓣花色表型如图1。

图1 草原龙胆12 个品系的花色Figure 1 Flower color of Lisianthus cultivars

1.2 方法

2016 年7 月5 日8∶00，分别从盛花期的草原龙胆不同单株上剪取完全开放的花朵。每个品系分别取15～20 朵花进行花色描述及色素定性，将剩余花朵分成3 份，每份鲜样0.5g，用锡纸包好，液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2.1 花色描述 分别取12 个品系的新鲜花瓣，放置于光线良好的室内，避免日光直射，将花瓣中上部分与英国皇家园艺学会比色卡（Royal Horticultural SocietyColor Chart，RHSCC）进行对比，描述花色[5]。

用色差仪（NF333 spectrophotometer，Nippon denshoku，光源C/2°）测量花瓣中上部分的亮度L*和两个色度成分a*值（从绿到红色）及b*值（从蓝色到蓝色），取平均值。使用国际照明委员会（International Commission on Illumination，CIE）系统进行分析。彩度 C*=（a*2+b*2）1/2 和色度角 h=arctan（b*/a*）。在 CIE L*a*b*系统中，L*值从0～100，代表着明度由暗到明的变化；色相a*值由负到正，表示绿色的减退、红色的增强；色相b*值由负到正，表示蓝色的减退、黄色的增强。彩度C*是描述色彩的鲜艳程度，C*值越大，颜色越深。色相角h°是对红、橙、黄、绿、青、蓝、紫7 种颜色色调的描述，0°附近是红色区域, 逆时针旋转经过橙色到达90°，其附近为黄色，180°附近是绿色区域，270°附近是蓝色区域，经过紫色区域，到达360°，又回到了红色区域[18]。

1.2.2 花色素定性分析 取草原龙胆各品系的新鲜花瓣各0.1g，分别加入5 mL 石油醚、5 mL 10% 盐酸以及5 mL 30% 氨水，观察并记录提取液颜色的变化情况[19]。

1.2.3 总花色苷含量测定 花瓣中花色苷的提取参考孙卫等的方法[20]。超高效液相色谱—二极管阵列检测器（Ultra performance liquid chromatography with a photodiodearray detector，UPLC-PAD）为美国 Waters 公司生产，该系统装备有高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、色谱工作站（Masslynx V4.1 数据处理软件）。色谱柱为 ACQUITYUPLC@BEH 的 C18 柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）。

UPLC 分析条件：柱温 45℃，流速 0.4 mL·min-1，进样体积 3μL。流动相 A 液为 0.1%的甲酸溶液（V 甲酸︰V 水 = 0.1∶99.9）；B 液为含 0.1%甲酸的乙腈 （V 甲酸∶V 乙腈 = 0.1∶99.9）。梯度洗脱程序：0 min，95% A，5% B；0.5 min，95% A，5% B；2.5 min，82% A，18% B；7.5 min，65% A，35% B；11 min，35% A，65% B；12 min，0% A，100% B；13 min，0% A，100% B；13.5 min，95% A，5%B；15 min，95% A，5% B。

在特征吸收波长520 nm 处检测总花色苷 （total anthocyanins，TA） 含量。以标准品氯化矢车菊（cyanidin chloride，Sigma）作为外标，通过标准曲线法对花瓣TA 进行定量。TA 为每g 新鲜花瓣中含有的相对于cyanidin的含量[21]。

1.2.4 花色苷组分分析 采用超高效液相色谱—四极杆飞行时间质谱联用仪（UPLC-Q-TOF-MS）对花瓣中花色苷结构进行分析。UPLC 配备同上，四级杆飞行时间质谱仪为Bruker 公司生产，采用Hystar 工作站。花色苷色谱分析条件同上，质谱分析条件：电喷雾电离，正离子检测模式，扫描范围为100 ～1500 m/z；毛细管电压3000V，锥孔电压 30V，提取锥电压 4V；锥孔气流量 60L·h-1，脱溶剂气流量 600L·h-1，干燥气（N2）流速 0.3mL·min-1；离子源温度110℃，干燥温度350℃。

1.3 数据分析方法

试验所得数据结果采用Microsoft Office Excel 2003 软件进行数据整理、分析及作图。数值为3 次重复的平均值±标准误差。使用SPSS 软件对花色表型和总花色苷含量进行相关性分析，利用EXCEL 对不同花色品种之间花色苷总含量的差异进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 花色描述

根据皇家比色卡（RHSCC）对花色的描述以及色差“CIELAB”分布（表1），12 个草原龙胆品系花色在CIE表色系统坐标系上分布广泛，亮度L* 的分布范围介于33 到95 之间，红绿属性a*值的分布范围介于-7 到62之间，黄蓝属性b*值的分布范围介于-58 到61 之间，彩度C*值的分布范围介于1 到75.45 之间，色相角h°值的分布范围介于-83.45 到23.75 之间。

草原龙胆12 个品系可分为4 个色系区域 （图2）分别是：白-黄色系（A），包括 White13、Yellow06 和 Yellow02；粉-紫色系（B），包括 Pink02、Pink Flash02、Misty Blue01 和 Lavender04；红-橙色系（C），包括 Carmine03、Apricot07 和 Brown01；蓝-紫色系（D），包括 Purple07 和Blue01。

2.2 花瓣色素类型

由表2 可知，石油醚测试中12 份草原龙胆花瓣提取液均为无色，表明花瓣含有很少含量或不含类胡萝卜素；盐酸测试中，除White13 品系外，其他品系花瓣提取液分别显示粉色、粉紫色和蓝紫色，表明花瓣含有花色素苷；而White13 和Yellow02 品系花瓣呈现无色和淡黄色表明这两个品系中不含有花色素苷。氨水测试中，12 种材料花瓣呈现淡黄色、黄色和锈黄色，表明含有黄酮类色素。综上，草原龙胆12 个品系花瓣均含有黄酮类色素，不含类胡萝卜素；除White13 和Yellow02 品系外，均含花色素苷。

图2 不同品种花色的'CIELAB' 分布Figure 2 Distribution of 'CIELAB'of different flower colors

表1 草原龙胆12 个品系的花色数据Table 1 Petal colors and color parameters of 12 cultivars of Lisianthus

2.3 草原龙胆花色苷成分分析

草原龙胆10 个含花色素苷品系的花瓣提取液经C18 柱分离，在520nm 波长下共检测到6 种花色苷物质（表3）。6 个花色苷物质的结构由UPLC-Q-TOF-MS分析进一步确定。

表3 草原龙胆10 个品系花瓣中花色苷的光谱及质谱特征Table 3 Spectrum and UPLC-MS properties of anthocyanins in petals of ten cultivars of Lisianthus

花色苷组分1，3，5，6 的A440/Avis-max值均小于0.2，表明这些花色苷的糖苷分别结合在花色苷元的3 位和5位。组分 2 和 4 的 A440/Avis-max值为 0.39 和 0.38，表明糖苷结合在花色苷元 3 位。组分 1，2，4 碎片离子 m/z303[Y0]+，是飞燕草素苷元（delphinidin）的特征质荷比，是飞燕草素花色苷衍生物，组分3 和6 含碎片离子m/z287[Y0]+，为矢车菊素（cyaindin）的特征质荷比，表明它们为矢车菊素花色苷衍生物。组分5 含碎片离子m/z271+，为天竺葵素（pelargonidin）的特征质荷比，是天竺葵素花色苷衍生物；花色苷所连糖苷种类通过分析各花色苷组分分子离子及碎片离子类型推定成分。花色苷组分 1 含分子离子 m/z 627[M]，碎片离子 m/z 465[M-（glucose）]+、303[Y0]+，其中m/z 303[Y0]+，是飞燕草素苷元（delphinidin）的特征质荷比，两个糖苷结合在花色苷元的3 位和5 位，通过与相关文献[22]中花色苷质谱特征的比对，组分1 推定为飞燕草3,5-二葡萄糖苷（delphinidin3,5-di-O-glucoside）。花色苷组分2 质谱分析得到分子离子m/z 465[M-（glucose）]，碎片离子303[Y0]+，对应飞燕草3-葡萄糖苷（delphinidin3-O-glucoside）的质谱特征；同理，根据质谱特征，组分3 质谱分析获得分子离子m/z 757[M]，碎片离子m/z 595[M-162（glucose）]+、449[M-308（coumaroylglucose）]+，推定为矢车菊素 3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷 （cyanidin3-O-coumaroylglucoside-5-O-glucoside）；组分4 质谱分析得到分子离子m/z 529 [M-204（acetyglucoside）]+、507 [M-（glucose）]+，碎片离子 303 [Y0]+推定为飞燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷 （delphinidin-3-O-acetyl-glucoside）；组分 5 质谱分析获得分子离子 m/z 783[M]，碎片离子 m/z 579[M-204（acetyglucoside）]+、475[M-308 （coumaroylglucose）]+推定为天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷 （pelargonidin3-O-coumaroylglucoside-5-O-acetyglucoside）；和组分 6 分子离子 m/z 843[M]，碎片离子 m/z 595[M-248（malonylglucoside）]+、535[M-308（coumaroylglucose）]+，推定结果为矢车菊素 3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷（cyanidin3-O-coumaroylglucoside-5-O-malonylglucoside）。

综上所述，草原龙胆10 个含花色苷的品系中一共检测到6 种花色苷物质，它们分别为飞燕草3,5-二葡萄糖苷、飞燕草3-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷、矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷。

2.4 草原龙胆的花色苷含量

2.4.1 总花色苷含量 12 个供试品系中除了白色和淡黄色的White13、Yellow02 花瓣中未含有花色素苷之外，其他10 个品系花瓣中总花色苷含量如图3 所示。紫色品系Blue01 和Purple07 总花色素苷含量最高，高达（1873±148）μg·g-1FW、（1531±122）μg·g-1FW，次之是红色品系 Carmine03，总花色素苷含量（953±78）μg·g-1FW，和橙-红品系Apricot07 的（427±53）μg·g-1FW。其余花瓣呈淡粉色、淡紫色和棕色的品系中总花色苷含量均在300μg·g-1FW 以下。棕色品系 Brown01 花瓣颜色很深，但花色苷含量并不高，为（312±24）μg·g-1FW，是 Blue01总花色苷含量的16.66%，黄酮类物质在花瓣中显色会导致颜色加深，棕色品系Brown01 花瓣中是否由黄酮类其他物质含量主导花色需要进一步检测分析。

图3 草原龙胆10 个品系花瓣中总花色苷含量Figure 3 Total anthocyanin content in the petals of 10 cultivars of Lisianthus

2.4.2 花色与总花色苷含量的关系 花色与花瓣中色素的组成、理化性质、液泡内pH 值以及花瓣表皮细胞性状与组织结构等诸多因素相关，但其中最重要的是色素组成。因此，为了探讨草原龙胆花瓣色素与花色的关系，以表征花色的亮度L*值、色相a*值和b*值、彩度C*和色相角h°作为因变量，色总色素苷成分的含量作为自变量，通过回归的方法建立花色与总色素苷含量之间的回归方程，推导出二者之间的数量关系。统计分析结果为：

L*=72.81-0.19x(R=0.607,p=0.063)；a*=17.35+0.22x(R=0.574,p=0.083)；b*=22.42-0.036x(R=0.614,p=0.059)；C*=28.08+0.28x(R=0.703,p=0.013)；h°=-20.76-0.13x(R=0.258,p=0.471)。

由回归系数R 和显著程度P 可以看出，并不是所有花色描述值都与总花色素苷含量有相关性，只有描述花色彩度的C*值与总花色苷含量具有显著的相关性（p=0.013），呈正相关。彩度描述意义为花色色彩的浓度，浓度越大，值越大；花色素苷总量越大，花色越浓，二者呈正显著正相关从CIELAB 系统证明花色苷含量对花色的直接影响关系。

2.4.3 各花色苷组分含量比例 草原龙胆花瓣花色素苷的组成及百分含量如表4。不同品系花瓣中分别含1～3种花色素苷，6 种花色素苷不会同时出现在一个品系的花瓣中。紫-蓝紫系中花色最深的两个品系Purple07 和Blue01 花瓣中主要呈色花色素苷是飞燕草3,5-二葡萄糖苷，同时含有少量的飞燕草3-葡萄糖苷。粉-紫色品系Misty Blue01 花瓣中飞燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷占总花色苷的61.87%，呈淡紫色；而同样粉-紫色品系Lavender04 花瓣中飞燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷占总花色苷的81.07%，而另一组分飞燕草3,5-二葡萄糖苷只占18.93%。红-橙色系中Carmine03 和Brown01 花瓣中天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷占总花色苷的61.09%和57.92%，比重大于矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷，而两个组分均为矢车菊素糖苷。粉-紫色品系Apricot07 花瓣中花色苷有3 种，其中天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷占45.1%和矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷占32.53%，矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷占22.37%。而粉-紫色品系Pink02 花瓣中花色苷组分主要是飞燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷，同时含有部分天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷。品系Yellow06是黄-白色系中唯一具有花色苷的花瓣，花色苷为天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷。

表4 草原龙胆10 个品系各花色苷所占比例Table 4 Distribution of anthocyanin components in 10 cultivars of Lisianthus

3 讨论与结论

花色素苷是花色素苷元与一个或多个糖苷等通过糖苷键结合而成，是花朵呈现红色、橙色、粉色、紫色的主要色素来源，由于环上不同位置的羟基化和甲基化修饰，在自然界中鉴定到的花色素至少有27 类，但是其中常见的只有6 类，分别是矢车菊素（cyanidin）、芍药素（peonidin）、天竺葵素(pelargonidin)、锦葵素(malvidin)、飞燕草素(delphinidin)和矮牵牛素(petunidin)[2，22]。天竺葵素通常呈现橙红至红色，矢车菊素则通常呈现粉色，飞燕草素通常呈现蓝色至蓝紫色[1]。本研究鉴定到蓝、蓝紫色系Purple07 和Blue01 花瓣主要呈色花色素苷为两种飞燕草素衍生物；粉色系Pink02 和Pink Flash02 花瓣中呈色花色素苷为矢车菊素衍生物；两个淡粉紫品系Misty Blue01 和Lavender04 花瓣呈色花色素苷为三种飞燕草素衍生物；黄色品系Yellow06 花瓣呈色花色素苷为天竺葵衍生物。这些结果与前人研究结果一致[3-7，23]。Yellow06 花瓣花色素苷总含量不高，但花色彩度很高，是否由于含有类黄酮类其他物质积累显色而成的，需要进一步对类黄酮类物质进行测定分析研究。

白新祥等在菊花中发现白色系仅由黄酮和黄酮醇组成；红色系和紫色系的色素是花色素苷、黄酮、黄酮醇等[3]；橙色系色素比较复杂，除了含有类胡萝卜素外，还含有黄酮和花色素苷。本研究结果与之符合，白色系中两个品系White13 和Yellow02 只含有黄酮类物质不含花色素苷，在其他10 个草原龙胆品系花瓣中鉴定到6种花色素苷成分，蓝紫色品系中含有飞燕草3,5-二葡萄糖苷、飞燕草3-葡萄糖苷和飞燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷；黄色品系中鉴定到天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷；粉色品系中含有矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷。本实验中蓝紫色系两个品系Purple07 和Blue01 主要含有花色苷成分是飞燕草3,5-二葡萄糖苷，其次为飞燕草3-葡萄糖苷，而淡紫色系中含有飞燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷，这些花色素苷均为飞燕草衍生物。

花朵的颜色被不少研究证实与花色苷种类及花色素苷含量密切相关。在本研究中，花色最深的两个品种Purple07 和Blue01 花瓣花色素苷总含量最高，其他品种花瓣中总花色素苷含量则相对较低，花色则相应较浅。同一色系的不同品种，花色素苷组分存在差异。如粉、粉紫色系4 个品种中Pink Flash02 含3 个组分，而Pink02、Misty Blue01 和Lavender04 则含2 个组分，且组分种类和相对含量均存在差异。同样，红-橙色系中Carmine03和Brown01 花色相近，含相同组分花色素苷，但含量不同；而Apricot07 含多一种组分，但其花瓣颜色反而浅，花色素苷组分差异从而产生花色的差异显著。花瓣中含有更大量的其它类黄酮类色素会影响花色素苷对花瓣着色的表型影响[24]，同时，花瓣细胞形状、液泡内酸碱度、细胞内金属离子种类和浓度、甚至是外部环境因子等因素也将对花色产生影响[25]。因此，后续将进一步围绕草原龙胆花色素苷稳定性分析以及黄酮类色素组分的分离展开研究。

综上所述，本研究分析了12 个草原龙胆品系花瓣花色类型，并从中检测出6 种花色素苷物质，通过比较不同色系花色素苷组成和含量以及花色之间的差异，深入探讨了花色差异的形成机制，为后续开展草原龙胆花色分子调控机理研究以及新花色品种培育提供依据。