中成药抑制巨噬细胞炎性细胞因子释放的体外研究*

郭 虹，蒲位凌，周 昆，韩立峰，郝 佳，常艳旭，高秀梅，王 涛

（天津中医药大学中医药研究院，天津 301617）

2019年底爆发的新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎，COVID-19）疫情，已在全世界百余国家和地区迅速传播，不但严重挤压医疗资源，更引起世界范围的恐慌。新型冠状病毒感染以发热、干咳、乏力为主要表现，重症患者出现急性呼吸窘迫综合征及多器官衰竭等症状。《柳叶刀》上发表的1项研究指出，在危重患者中可见“细胞因子风暴”发生[1]。新型冠状病毒感染后，短时间内大量产生多种细胞因子，导致人体免疫系统功能的紊乱，造成严重机体损伤，这种极端的免疫攻击即称之为“细胞因子风暴”。新型冠状病毒感染重症患者血浆白介素（IL）-6、IL-10等炎性细胞因子明显升高[2]。有研究分析了123例COVID-19病例的细胞免疫和细胞因子情况，观察到重症组IL-6升高的比例明显高于轻症组[3]。这些数据均提示重症COVID-19患者存在炎性反应水平高的特点。

目前临床主要应用糖皮质激素平息细胞因子风暴，但糖皮质激素是一把“双刃剑”，除了引起骨质疏松的不良反应，其免疫抑制作用还会阻碍机体对病毒的抵抗和清除，限制了它在COVID-19的应用。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》中强调“较大剂量激素会延缓对冠状病毒的清除”。因此，寻找能有效干预和缓解细胞因子风暴的治疗药物，是目前防治COVID-19的迫切之需。

COVID-19属于中医“疫病”范畴，在数千年中华文明史上，中医药学对于瘟疫诊治积累了丰富的临床经验。对待新发病毒疫情，如何结合传统中医理论防治疫病，发挥中医药防疫抗病能力成为中医药人的重要课题。目前中成药品种在药效物质、工艺品质等方面都有系统深入的研究，质量稳定，工艺可靠[4]。从已有中药中发现有活性药物用于疫情防治方面具有临床转化快速、使用安全性强等突出优势。本研究收集了60余种市场在售中成药，从中药抑制细胞因子风暴角度入手，采用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞建立体外炎症模型，考察药物对一氧化氮（NO）生成和细胞因子释放的抑制作用，为寻找能降低病毒感染所致细胞因子风暴水平的中成药提供研究基础。

1 实验部分

1.1 仪器与材料 二氧化碳（CO2）培养箱，美国Thermo公司；IX53倒置相差显微镜，日本Olypums公司；Spark多功能酶标仪，瑞士Tecan司；RAW264.7小鼠巨噬细胞株购自ATCC（SC-6003）；LPS，美国Sigma公司；细胞活力检测试剂盒、NO检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒，美国 R＆D 公司；小鼠多因子炎性因子检测试剂盒，美国MesoScaleDiscovery公司；二甲基亚砜（DMSO），北京索莱宝科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、双抗，均为美国Gibco公司；乙醇为分析纯，天津康科德科技有限公司。

1.2 中成药提取 收集的上市中成药均经粉碎（喷雾剂使用原料）后以10倍70%乙醇溶液（W/V）进行30 min超声提取，以4 000 g离心10 min，离心半径18 cm，取上清液于40℃减压浓缩干燥。干燥粉末以DMSO配制为50 mg/mL浓度备用。

1.3 细胞培养 RAW264.7细胞培养于含10%热灭活胎牛血清的DMEM培养液中。待细胞处于对数生长期，加入胰蛋白酶消化，形成单细胞悬液转移至离心管中，1000 r/min离心5min，离心半径14.5cm，弃上清，加入培养液细胞计数后，接种于新的培养瓶内，放置于5% CO2、37℃培养箱中培养。

1.4 细胞活力检测 收集对数生长期的RAW264.7细胞，按1×105/mL密度接种于96孔板。48 h后分别加入不同中成药提取物。加药处理24 h后，取出培养板，吸去上清液，每孔加入100 μL稀释的CCK-8溶液，37℃孵育30min，酶标仪于450nm处检测吸光度（A值）。

1.5 Griess法检测NO 将RAW264.7细胞以1×105/mL密度接种于96孔板，48 h后分组处理细胞。空白组不做任何处理；模型组加入终浓度1 μg/mL LPS诱导炎症；药物处理组分别用不同中成药提取物和LPS共同孵育，24 h后收集细胞上清液，按照试剂盒说明书分别加入Griess ReagentⅠ和Ⅱ，酶标仪于540 nm处测定吸光度，用标准品溶液的吸光度与浓度做标准曲线，计算各样品处理细胞上清液中NO的浓度。

1.6 细胞因子检测 分组及处理方法同1.5，收集细胞上清液待测。一部分上清液稀释后按ELISA试剂盒操作说明，检测TNF-α含量。一部分上清液按照小鼠多因子炎性因子检测试剂盒说明书操作，用稀释液进行1∶1稀释后检测炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10等的含量。以各中成药提取物的高剂量抑制率做雷达图，抑制率（%）＝（模型组-给药组）/（模型组-空白组）×100%。

1.7 统计方法 使用SPSS 20.0软件包进行分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05时认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 中成药对RAW264.7细胞活力的影响 首先采用CCK-8法检测不同中成药提取物在50 μg/mL时对正常RAW264.7细胞活力的影响。结果显示，牛黄清心丸（局方）（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂）提取物在50 μg/mL时对正常RAW264.7细胞活力无影响，而藿香正气软胶囊（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂）、牛黄解毒丸（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂）、穿心莲内酯滴丸（天士力医药集团股份有限公司）3个中成药提取物在 50 μg/mL时对RAW264.7细胞活力有明显抑制作用。

因此进一步降低药物浓度，考察藿香正气软胶囊、牛黄解毒丸、穿心莲内酯滴丸3个中成药提取物在25 μg/mL对RAW264.7细胞活力的影响。结果显示，藿香正气软胶囊、牛黄解毒丸、穿心莲内酯滴丸3个中成药提取物在25 μg/mL剂量下对正常培养RAW264.7细胞活力均无影响，见图1。

2.2 中成药对NO生成的抑制作用 选用LPS诱导RAW264.7细胞复制体外炎症损伤模型，考察药物对NO生成量的抑制作用。结果显示，与空白组比较，模型组NO生成显著增加，说明LPS诱导炎症模型成功；与模型组比较，牛黄清心丸（局方）、藿香正气软胶囊、牛黄解毒丸、穿心莲内酯滴丸均能显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞NO生成量，提示以上药物可能具有抗炎作用，见图2。

2.3 中成药对细胞因子分泌的调节作用 细胞因子失衡可引发炎症级联反应、是导致全身性免疫失调的重要因素，本研究利用LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，在各中成药有效抑制NO的剂量下，考察了药物对多种细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10）分泌的调节作用。实验结果表明，LPS引起 TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10 分泌升高，牛黄清心丸（局方）、藿香正气软胶囊、牛黄解毒丸、穿心莲内酯滴丸的高剂量组均能显著抑制LPS诱导的细胞因子生成，见表1。为将多因子的药效结果可视化，采用雷达图表示不同药物的综合效果。雷达图中 TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10 为 5 个维度，最外维表示抑制率100%，越靠近中心点表示抑制率越低。综合药效以穿心莲内酯滴丸最明显，其他药物对各细胞因子有不同程度的抑制作用，见图3。

3 讨论

病毒性肺炎是一种由病毒感染引起的急性呼吸道传染病，由上呼吸道向下蔓延引发肺部炎症，导致肺换气功能障碍。研究显示，呼吸道病毒感染常导致机体的细胞因子水平异常，重症患者血浆中IL-1β、IL-6、MCP-1 和 TNF-α 等细胞因子显著增高，形成“细胞因子风暴”[5]。“细胞因子风暴”反应主要发生在肺部的血管壁内皮细胞，感染可能会导致大量免疫细胞向肺部集中，同时使肺部血管通透性增大，可导致肺炎、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、呼吸衰竭、休克等症状，严重者可能导致死亡[6]。

自严重急性呼吸综合征（SARS）疫情爆发以来，“细胞因子风暴”就引发高度关注。SARS病毒，甲型H1N1流感病毒，H7N9高致病禽流感病毒等多种病毒均可导致“细胞因子风暴”[7-9]。肺炎患者预后差通常与下呼吸道和其他组织中的促炎细胞因子水平极高有关[10]。专家发现，上述病毒感染患者均会出现肺细胞脱屑和透明膜形成等病理特征，提示发生了ARDS[11]。而导致ARDS的发病原因正是与细胞因子风暴有关[12]。因此目前临床治疗中，尤其对于危重症患者如何抑制炎症反应及细胞因子风暴是大家关注的焦点。

表1 中成药对细胞因子的调节作用（±s）Tab.1 Regulatory effect of Chinese patent medicine on cytokines（±s）

表1 中成药对细胞因子的调节作用（±s）Tab.1 Regulatory effect of Chinese patent medicine on cytokines（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；“0.22”是检测下限，统计计算时以 0.22 计。

组别 剂量（μg/mL） TNF-α（pg/mL） IL-1β（pg/mL） IL-2（pg/mL） IL-6（pg/mL） IL-10（pg/mL）空白组 — 56.58± 7.75 0.35±0.07 0.22 0.68±0.75 579.79± 9.98模型组 — 7 590.40±3 337.15 6.01±1.27* 2.07±0.29* 470.26±39.85* 1 482.76±165.99*牛黄清心丸（局方） 50.0 2 856.00± 22.51### 0.45±0.02### 0.64±0.10## 139.67±24.13### 890.59± 44.15###25.0 5 261.68± 927.20 4.45±3.07 0.77±0.14## 645.33±24.10# 1 647.52±113.90##藿香正气软胶囊 25.0 4 240.91± 606.85# 1.17±0.68### 0.22### 176.23±79.94### 1 046.95± 48.57###12.5 4 119.96±1 490.18# 0.90±0.10### 0.22### 278.41±92.81# 1 088.35± 53.77###牛黄解毒丸 25.0 537.92± 81.66### 0.91±0.60### 0.22### 67.16± 9.16### 347.47± 22.65###12.5 1 749.76± 489.10### 1.79±0.27### 0.22### 184.79±22.82### 921.37± 45.68###穿心莲内酯滴丸 25.0 55.12± 2.90### 0.28±0.02### 0.22### 4.71±1.78### 93.54±17.63###12.5 101.26± 14.31### 0.36±0.04### 0.22### 10.77± 0.07### 249.73± 14.39###

“细胞因子风暴”实际是人体免疫系统针对外界病毒和感染的过度反应，对自身也会造成伤害。因此，调节自身的免疫平衡状态具有重要的意义。本研究采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，从已上市中成药出发，寻找能有效抑制“细胞因子风暴”的中成药制剂，为临床治疗病毒性肺炎提供参考。研究结果表明，牛黄清心丸（局方）、藿香正气软胶囊、牛黄解毒丸、穿心莲内酯滴丸等中成药对LPS诱导RAW264.7细胞NO生成有显著抑制作用，对多种细胞因子分泌有调节作用，雷达图显示在相同剂量下综合药效以穿心莲内酯滴丸最明显，结果提示这些上市中成药有应用于防治病毒性肺炎的前景。值得注意的是，IL-10常被认为是抗炎因子，但在本研究中，LPS刺激后模型组IL-10分泌量较对照组升高，这可能是由于巨噬细胞在受到外源因子刺激，反馈性增加IL-10分泌，这也与肺炎IL-10报道相一致[13]。药物干预后可使炎症水平降低，从而恢复近正常水平。现代药理学研究表明牛黄清心丸局方、藿香正气软胶囊、牛黄解毒丸中牛黄、黄芩、冰片、甘草等确有抑制细胞因子分泌的作用[14-17]，且牛黄、黄芩、甘草有抗病毒报道[18-20]，与本研究结果相一致。本研究初步证实了牛黄清心丸局方、藿香正气软胶囊、牛黄解毒丸、穿心莲内酯滴丸等临床常用中成药潜在的防治“细胞因子风暴”的作用，可为进一步临床应用和相关基础研究提供一定线索。