177Lu-DOTA-MHI 148多模态显像剂在乳腺癌MCF-7鼠瘤模型的体内分布及活体成像研究

黄美盈，袁耿彪，潘东风，何雨蓓，李倩茹

重庆医科大学附属第二医院核医学科，重庆 400010； *通讯作者 袁耿彪 yuan_gb@126.com

肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一，近年发病率呈逐年增长的趋势。各种现代成像技术广泛应用于监测肿瘤组织的结构、功能和分子变化，包括光学成像（通过生物发光或荧光）、CT、MRI、PET、SPECT及超声[1]。每种成像方法均有其独特的强度和内在的局限性，使得在疾病部位获得精确可靠的信息变得困难[2]。多模态分子成像结合2 种或以上的检测技术，形成一种新的成像方法，便于在诊断、治疗、监测等方面获得进一步的信息。目前，多模态分子成像已广泛应用于医学研究和临床实践的优化，对心血管疾病、神经精神疾病[3]和其他临床疾病[4]均有帮助；还能显著提高肿瘤边界的定位，有效指导肿瘤的手术切除[5]。

由于近红外荧光成像在生物成像方面仍存在一定的缺点，如组织渗透性较低，在癌症的临床应用中仅适合浅表部位肿瘤的显像，故本实验选用乳腺癌鼠瘤模型。本研究将近红外荧光染料MHI 148、螯合剂1，4，7，10-四氮杂环十二-1，4，7，10-四乙酸（1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid，DOTA）与放射性核素177Lu 结合，形成多模态分子探针177Lu-DOTA-MHI 148，将探针注入荷乳腺癌裸鼠体内，同时采用近红外成像与γ 闪烁成像提高对肿瘤的诊断效率。本实验拟采用177Lu标记DOTA-MHI 148，并对标记物在乳腺癌MCF-7裸鼠体内生物分布及活体成像进行研究，为进一步实现177Lu-DOTA-MHI 148 对肿瘤的诊疗一体化提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 近红外荧光染料DOTA-MHI 148（弗吉尼亚大学放射医学系惠赠）；人乳腺癌细胞系MCF-7 细胞株（重庆医科超声研究所）；177Lu 核素（西南医科大学核医学科）；裸鼠（重庆医科大学实验动物中心），本研究符合重庆医科大学附属第二医院实验动物伦理委员会制订的伦理学标准；盐酸、醋酸钠（成都科龙化工试剂厂）；CRC-15R 活度计（美国Capintee 公司）；SPECT 显像仪（美国GE 公司）；SN-695B 型智能放免γ 计数器（上海物理研究所日环光电仪器有限公司）。

1.2177Lu-DOTA-MHI 148 的制备及标记率的测定取DOTA-MHI 148 20 μg溶于10%乙醇溶液（1 mg/ml）放入EP 管中，将177LuCl32 mCi 和0.25 mol/L 醋酸钠溶液加入上述溶液中，调整酸碱比为3∶1，于90℃下反应30 min。采用高效液相分析法（HPLC）测定177Lu-DOTA-MHI 148 标记率。HPLC 色谱条件：C18 色谱柱；紫外检测器，波长220 nm；流速1 ml/min；溶剂A 为0.1% TFA 的乙腈溶液，溶剂B 为0.1% TFA 的水溶液采用梯度洗脱：0～20 min 5%～85%溶剂A，20～25 min 85%～5%溶剂A。

1.3 构建裸鼠乳腺癌动物模型 将人乳腺癌细胞MCF-7 用RPMI 1640 细胞培养液（含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗）在37℃、5% CO2及常规湿度条件下培养，待细胞处于对数生长期时，用胰蛋白酶消化1 min，调整细胞数量至2.5×107/ml。选取18 只4 周龄左右的雌性裸鼠，将0.1 ml 细胞悬液接种至雌性裸鼠右侧大腿皮下。待肿瘤长至大于1.0～2.0 cm3时备用。

1.4177Lu-DOTA-MHI 148 在MCF-7 乳腺癌细胞荷瘤裸鼠的生物分布 选取12 只荷瘤裸鼠，随机分成3 组，每组4 只。尾静脉注射100 μl177Lu-DOTA-MHI 148（0.1 mCi），分别于注射12、24、48 h 后处死3 组裸鼠，取心脏、肝、脾、肺、肾、胃、肠、股骨、肿瘤、血液、左侧大腿肌肉等组织器官，用天平准确称量器官重量，用γ计数器检测各个器官的放射性计数。然后根据公式（1）计算各组织每克组织的百分注射剂量率（%ID/g）。

1.5177Lu-DOTA-MHI 148 在MCF-7 荷瘤鼠体内的γ闪烁成像 按照上述标记条件标记177Lu-DOTA-MHI 148 备用。选取3 只已空腹6 h 的荷瘤鼠，准备3 支一次性无菌注射器，每支注射器取0.1 ml177Lu-DOTA-MHI 148（0.3 mCi），在注射放射性药物8、24、48 h 后，将裸鼠俯卧位固定于泡沫板上，进行SPECT 静态显像，每个时间点连续采集10 min，并观察177Lu-DOTA-MHI 148 在裸鼠体内的放射性浓聚随时间的变化情况。采用针孔准直器SPECT 显像仪进行图像采集，主能峰为208 keV，副能峰为113 keV，矩阵128×128，放大倍数为3 倍。

1.6 裸鼠活体近红外荧光成像 取3 只接种成功的裸鼠，准备3 支一次性无菌注射器，每支注射器取177Lu-DOTA-MHI 148 100 μl，注射放射性药物1、6、24、48、72 h 后进行活体荧光成像。激发光/发射光为740 nm/820 nm。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件，计量资料以±s表示，采用配对t检验进行比较，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1177Lu-DOTA-MHI 148 的标记率及稳定性 以90℃、pH 5～6、DOTA-MHI 148 20 μg、177LuCl32 mCi为制备条件，新鲜制备177Lu-DOTA-MHI 148（图1），测得其1 h 时标记率为（97.83±0.62）%（图2）。在室温25～27℃条件下，放置24 h 后，标记物的标记率略微降低，为（95.75±0.56）%，仍高于95%（图3），1 h 与24 h 稳定性差异有统计学意义（P=0.012），177Lu-DOTA-MHI 148 在室温条件下具有较好的体外稳定性。

2.2177Lu-DOTA-MHI 148 荷MCF-7 裸鼠体内的生物分布177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠体内主要分布于肿瘤、血液、心、肝、肾等组织，随着注射药物后时间的增加，血液、心、肝、肾的%ID/g 逐渐降低，肿瘤的%ID/g 随着注射药物时间的增加而逐渐增加，表明177Lu-DOTA-MHI 148 在肿瘤组织中有较长的滞留时间，并且在48 h 时，肿瘤内标记物分布达到最大，且肿瘤/肌肉比值达到最高，为40.53±16.09（表1）。

图1 177Lu-DOTA-MHI 148 的分子结构式

图2 1 h 时177Lu-DOTA-MHI 148 的HPLC 图谱

图3 室温放置24 h 后，177Lu-DOTA-MHI 148 的HPLC 图谱

表1 177Lu-DOTA-MHI 148 在荷人乳腺癌裸鼠体内的生物分布（%ID/g，±s，n＝4）

表1 177Lu-DOTA-MHI 148 在荷人乳腺癌裸鼠体内的生物分布（%ID/g，±s，n＝4）

部位12 h 24 h 48 h心脏 1.64±1.23 0.93±0.27 0.78±0.12肝1.85±0.15 1.28±0.41 0.89±0.33脾 0.33±0.05 0.22±0.08 0.17±0.06肺0.57±0.05 0.36±0.11 0.20±0.08肾 2.65±0.86 1.07±0.25 0.46±0.22胃0.41±0.31 0.23±0.11 0.14±0.06骨骼 0.41±0.18 0.28±0.09 0.24±0.04肌肉0.23±0.04 0.16±0.04 0.11±0.03结肠 0.29±0.04 0.23±0.10 0.16±0.07血液3.16±1.87 2.09±0.77 1.01±0.13肿瘤 0.94±0.17 1.68±0.62 4.69±2.28肿瘤/肌肉比4.18±1.55 12.73±8.60 40.53±16.09

2.3177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠体内的γ闪烁成像 注射放射性药物177Lu-DOTA-MHI 148 后，显像图示，随着时间增加，肿瘤逐渐放射性浓聚增加，而其他各器官放射性分布逐渐减退，在48 h 时肿瘤显像显示荷瘤裸鼠的肿瘤部位有较高浓度的放射性摄取（图4）。

2.4177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠体内的近红外荧光成像 荷瘤裸鼠经尾静脉注射177Lu-DOTA-MHI 148 1 h 后，肝脏、心脏部位即刻显影。肿瘤显影较弱。随着时间的推移，肿瘤部位荧光逐渐增强，肿瘤周背景荧光相对减弱，48 h 时肿瘤显影效果最佳，并延续至72 h。使用仪器自带软件测量发现整个成像过程中肿瘤部位的荧光强度始终高于正常部位的荧光强度（图5）。

图4 荷人乳腺癌裸鼠注射177Lu-DOTA-MHI 148（0.3 mCi）后，分别于8 h（A）、24 h（B）、48 h（C）进行γ 闪烁成像，显示肿瘤位置（箭）

图5 荷人乳腺癌裸鼠注射177Lu-DOTA-MHI 148 后分别在1、6、24、48、72 h（A～E）的近红外荧光显像情况及肿瘤与对照部位荧光强度测量值，肿瘤荧光信号明显强于周围皮肤

3 讨论

近红外荧光成像的发射波长为600～900 nm，在此波长范围内吸收近红外光的物质少，在传播过程中受到的干扰很小。同时近红外成像具有高信噪比、高灵敏度、高分辨率、低成本、无创伤性、生物相容性好等优势[6-7]。近红外荧光七甲川花菁染料，如IR-780、IR-783 和MHI 148 等，具有亲脂性，不需要化学修饰，不需要与肿瘤特异性分子连接，自身即可高效蓄积在肿瘤细胞中，可被多种肿瘤细胞摄取，而在正常细胞内摄取较少或无摄取，其进入生物体后，可聚集在肿瘤组织，且近红外荧光信号可保持较长时间，而不聚集或仅少量聚集在正常组织中[8]。

Zhang 等[9]研究证实此类近红外荧光吲哚七甲川菁染料能在肿瘤细胞线粒体中蓄积，与肿瘤细胞中的有机阴离子转运肽及缺氧诱导因子1α 有关。SLCO 基因编码的有机阴离子转运多肽是介导多种临床药物和内源性营养物质跨膜转运的重要转运蛋白超家族[10]。HIF1 族经常在多种类型的肿瘤中表达，并且通常与不良预后和快速表达疾病表型的预后相关。

既往已有研究将近红外荧光七甲川花菁染料MHI 148与螯合剂DOTA结合形成DOTA-MHI 148，将其命名为探针PC-1001，用放射性核素64Cu 标记探针PC-1001 构成64Cu-PC-1001，有效实现了乳腺癌近红外荧光与正电子发射断层显像[11]。后来又将近红外荧光七甲川花菁染料MHI 148 与联肼尼克酰胺相连，命名为PZ-1009。再与99Tcm结合，做成探针99Tcm-PZ-1009[11]，有效实现了关于近红外荧光与单光子发射断层显像双模式成像的研究。

本实验选用放射性核素177Lu，是较为理想的医用放射性核素。与其他核素相比，177Lu 具有以下优点：①衰期较长（6.647 d），可供远距离运输，以及允许复杂的程序合成和纯化放射性药物；②177Lu 通过反应堆大规模生产，易于获得，价格低廉，比活度高；③可以发射出能量为112.95 keV（6.40%）、208 keV（11.00%）、321.3 keV（0.219%）、249.7 keV（0.212%）、和71.65 keV（0.15%）的γ 射线，可通过使用传统SPECT 显像，可对病灶进行定位和测量，便于观察患者体内放射性药物分布情况；④177Lu 能发射3 种能量分别为498 keV（79.3%）、380 keV（9.1%）和176 keV（12.2%）的β 粒子，用于肿瘤的治疗[12]。β 粒子的能量射程短，能够在对肿瘤组织进行治疗的同时减少正常组织损伤，并且对骨髓的抑制作用较轻。

然而，放射性核素探针也有其缺点，如空间分辨率低、暴露于辐射下、基础代谢率高的组织（如大脑）大量摄取。由于七甲川花菁近红外荧光小分子MHI 148 为亲脂性阳离子化合物，不需要与另外的化学基团连接，可直接被肿瘤摄取，在癌细胞中特别积聚，并可通过近红外荧光成像对肿瘤进行影像诊断。因为放射性核素成像比近红外荧光成像具有更好的组织渗透性，核素成像和光学成像是提高荧光在生物组织中穿透深度的一种有吸引力的组合[13-14]。这种组合的造影剂不仅在成像中提供了详细的空间分辨率，而且提高了肿瘤的诊断水平。

七甲川菁类染料MHI-148 具有良好的肿瘤聚集特性和较高的量子产率，在正常组织中显示低摄取/滞留，代表一种新的肿瘤成像探针[15]。这些染料通过与放射性核素结合进一步修饰，放射性同位素标记染料不仅可以解决常规近红外荧光染料渗透性差的问题，实现无创成像，并且可以用于确定肿瘤的发生程度。近红外光谱结合放射性同位素显像可以为肿瘤的早期诊断提供新的方法。

本研究发现177Lu-DOTA-MHI 148 对乳腺癌具有良好的靶向作用。将该分子探针注入荷瘤裸鼠体内48 h 后，在近红外荧光成像与γ 闪烁成像中，肿瘤显像清晰，并且肿瘤可在177Lu-DOTA-MHI 148 注射后较长时间仍能清晰显示。此外，体内生物分布的实验结果显示随着注射时间的增加，肿瘤中177Lu-DOTA-MHI 148 的摄取逐渐增加，而其他正常组织中177Lu-DOTA-MHI 148 的摄取随着时间的增加而减少，并且在48 h 时177Lu-DOTA-MHI 148 在肿瘤中的摄取高于其他正常器官组织。该化合物能迅速从血液中清除，并通过肾脏排泄。

本研究的局限性：①MHI 148 进入肿瘤细胞的具体机制目前不清楚，有待进一步研究；②尽管该药物在肿瘤中摄取较高，但仍有一部分在肾、肝、心脏代谢器官中摄取，其摄取的特异性有待进一步提高；③本实验对放射性核素177Lu 的治疗作用未进一步研究，该多模态分子探针177Lu-DOTA-MHI 148 的诊疗一体化作用尚有待通过进一步的实验进行验证。