响应面法优化沙棘果粉黄酮提取工艺的研究

米智，刘荔贞，武晓红

(1.山西大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学 化学与环境工程学院，山西 大同 037009)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn., sea buckthorn)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)多年生落叶灌木或小乔木，又名醋柳、黑刺等，广泛分布在欧亚地区。我国沙棘分布面积约占全球的95%以上，是沙棘资源的主要生产国，素有“沙棘王国”之称[1]，多分布于华北(山西)、西北(甘肃)、西南(四川)等干旱地区[2]。沙棘历来都是惯用的蒙、藏药材，作为一种药食同源的植物被广泛关注，藏医名著《四部医典》、《月王药疹》，蒙药名著《无误蒙药鉴》，清代药学经典《晶珠本草》及《中国药典》均对沙棘的药效做了记录，其具有止咳祛痰、消食化滞、活血散淤、壮阴升阳等功效[3]。沙棘中富含挥发油类、微量元素和黄酮类化合物等多种具有生物功能和活性的营养成分，具有较高的医用保健价值，享有“生命能源”、“绿色黄金”和“维C之王”等美誉[4]。

据相关文献报道，在沙棘中已分离出近40种黄酮类化合物，丰富的黄酮含量使沙棘具有防癌、抗癌、提升心脑血管系统、免疫系统、降血糖、降血脂的功效以及抗辐射、抗氧化、抗抑郁、抗菌消炎、保护肝脏等多种药理作用[5-8]。人类的衰老和许多疾病与自由基的氧化反应有关[9]，而黄酮又是一种抗氧化活性物质，能够减少基体的氧化损伤[10]。沙棘中黄酮类物质具有多种较高的药理价值，也是功能性食品添加剂，如：天然甜味剂、天然风味增强剂、天然色素等[11]。

植物黄酮类化合物具有广泛的药理活性，已在诸多行业得到广泛应用[12]，提取黄酮类物质的工艺有回流提取法、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法、闪式提取法等方法[13-15]，本文采用索氏提取法，因其具有能耗低、操作简便、得率高等优点而被实验室广泛采用。

因此，为了促进沙棘资源的开发利用和深入研究，本文以沙棘果粉为原料，利用响应面法优化索氏提取黄酮工艺，为更好地开发和利用沙棘等天然资源提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘果粉：购于山西吕梁文水县醋柳山生物科技公司；硝酸铝、芦丁、亚硝酸钠、无水乙醇、氢氧化钠等：购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

精密电子天平、数显恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、索氏提取器、电热套、电热恒温鼓风干燥箱等。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的建立

准确称取芦丁标准品10 mg，加少量95%乙醇，摇匀，在超声波辅助下使之充分溶解，用60%乙醇定容至50 mL，得0.2 mg/mL芦丁标准液[16]。取6个干燥洁净的25 mL容量瓶，按表1顺序加入试剂。

表1 芦丁标准曲线的制作Table 1 The making of rutin standard curve

以0号容量瓶为空白对照，在510 nm处用紫外可见分光光度计测定吸光值，测3次求平均值，做回归处理。

1.3.2 沙棘果粉处理及黄酮提取工艺流程

将沙棘果粉放入电热恒温鼓风干燥箱中，在40 ℃下干燥至恒重，称重，用滤纸分装小包，以乙醇为溶剂，在索氏提取器中回流提取，定容待测。

精确量取1 mL提取液作为待测液，方法同1.3.1，在510 nm处测吸光值，做3组平行试验求平均值，代入线性回归方程，得到沙棘果粉总黄酮的含量(%)。

式中：C为沙棘果粉总黄酮浓度(mg/mL)；N为稀释的倍数；V为提取液总体积(mL)；W为试验样品的质量(g)。

1.3.3 沙棘果粉总黄酮提取工艺的单因素试验

参照米智等[17]的方法，准确称取2 g沙棘果粉，在料液比为1∶25 (g/mL)、提取时间为2.0 h、提取次数为2次的前提下，设置不同乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)对沙棘果粉总黄酮提取量的影响；在乙醇浓度为70%、提取时间为2.0 h、提取次数为2次的前提下，设置不同料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)对沙棘果粉总黄酮提取量的影响；在乙醇体积分数为70%、料液比为1∶25、提取次数为2次的前提下，设置不同提取时间(1.0，1.5，2，2.5，3.0 h)对沙棘果粉总黄酮提取量的影响；在乙醇体积分数为70%、料液比为1∶25、提取时间为2.0 h的前提下，设置不同提取次数(1，2，3，4，5次)对沙棘果粉总黄酮提取量的影响。每个单因素试验重复3次，试验数据采用Excel软件进行方差分析。

1.3.4 响应面试验设计及统计学处理方法

根据沙棘果粉总黄酮提取工艺中各个单因素试验结果可得，在选取的4个因素中分别选取3个对沙棘果粉黄酮提取量影响最大的水平，以黄酮提取量为考察目标，运用Design-Expert V8.0.6.1软件进行响应面试验设计，根据Box-Behnken中心组合设计原理，确定建立响应面试验方案，求得回归方程预测模型，并确定沙棘的黄酮最佳提取工艺。

1.3.5 沙棘果粉总黄酮提取工艺的验证性试验

为了更好地验证索氏提取法提取沙棘果粉总黄酮的可靠性和合理性，在响应面试验结果的基础上，进行了3次平行验证性试验，并计算相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以芦丁浓度(C，m/V)为横坐标，吸光值OD510为纵坐标，制作标准曲线，得出线性回归方程为：Y=9.017X-0.102，R2=0.991。

2.2 沙棘果粉总黄酮提取工艺的单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对提取结果的影响

图1 乙醇浓度对沙棘样品黄酮量的影响Fig.1 Effect of ethanol content on the flavonoids amount of Hippophae rhamnoides Linn. powder

由图1可知，当乙醇浓度低于70%时，沙棘果粉黄酮提取量随着乙醇浓度增大而提高；在乙醇浓度为70%时黄酮提取量达到最大，约为2.13%；当乙醇浓度超过70%后，随着乙醇浓度的提高，黄酮提取量反而降低。因此在做响应面试验时，选取乙醇浓度3个水平分别为60%、70%和80%。

2.2.2 料液比对提取结果的影响

图2 料液比对沙棘样品黄酮量的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the flavonoids amount of Hippophae rhamnoides Linn. powder

由图2可知，沙棘果粉黄酮提取量随着料液比的增大而提高，当料液比为1∶30时，沙棘果粉黄酮提取量达到最大值，约为2.05%;而料液比为1∶25时，黄酮提取量为2.04%。当料液比继续增大时，黄酮提取量反而降低。因此在做响应面试验时，选取料液比3个水平为1∶20、1∶25和1∶30。

2.2.3 提取时间对提取结果的影响

图3 提取时间对沙棘样品黄酮量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the flavonoids amount of Hippophae rhamnoides Linn. powder

由图3可知，当提取时间不足2.5 h时，沙棘果粉黄酮提取量随着提取时间的延长而提高；且提取2.5 h时黄酮提取量达到最大值，约为1.94%；提取时间为2.0 h时，黄酮提取量为1.93%。随着提取时间的延长，沙棘果粉黄酮提取量反而有所降低。因此在做响应面试验时，选取提取时间3个水平为1.5，2.0，2.5 h。

2.2.4 提取次数对提取结果的影响

图4 提取次数对沙棘样品黄酮量的影响Fig.4 Effect of extraction times on the flavonoids amount of Hippophae rhamnoides Linn. powder

由图4可知，当提取次数在1～4次时，沙棘果粉黄酮提取量随着提取次数的增加而提高；且提取4次时黄酮提取量达到最大值，约为2.10%；提取2～4次时，沙棘黄酮量比较相近。当提取次数再增加时，黄酮提取量有所降低。因此在做响应面试验时，选取提取次数3个水平为1，2，3次。

2.3 回归模型的建立及其分析

响应面试验方案见表2，响应面试验结果见表3。

表2 响应面试验因素与水平的确定Table 2 Determination of factors and levels of response surface methodology

表3 响应面试验结果表Table 3 The results of response surface methodology

续 表

建立沙棘果粉黄酮提取工艺条件的回归模型方程，获得本试验考察指标(黄酮提取量)的响应值(Y)对各自变量A(乙醇浓度)、B(料液比)、C(提取时间)和D(提取次数)的二次多项式回归方程：沙棘果粉黄酮提取量Y=-23.08167+0.40608A+0.4815B+4.06167C+0.8575D+3.0E-4AB+2.5E-3AC+8.0E-3AD-0.02BC-0.0145BD-0.125CD-3.05E-3A2-8.8E-3B2-0.875C2-0.18375D2。

以沙棘果粉黄酮提取量为考察指标，对试验模型进行方差分析和对模型系数进行显著性分析，见表4。

表4 二次模型的方差分析Table 4 Variance analysis of the quadratic model

由表4可知，二次项回归模型在统计学上呈极显著(P<0.01)，说明该提取黄酮试验模型具有统计学意义；且通过P值可知模型中变量A、D、A2、B2、C2和D2对提取量的影响极显著，交互项AD和BD对模型的影响显著，说明试验因素与响应值不是简单的线性关系，一次项、二次项、交互项对响应值均有很大的关系；失拟项结果为不显著(P=0.1299>0.05)，说明该试验模型具有较好的拟合度，方程模型的残差可能来源于试验过程中的随机误差。模型的RAdj2=0.9149，说明试验可靠、误差小，该模型能解释91.49%的响应值变化，R2为0.9574，表明提取量的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，该模型可预测沙棘果粉黄酮提取的实际情况。在试验所选取的各因素中，乙醇浓度>提取次数>料液比>提取时间。

图5 提取次数和料液比对沙棘果粉黄酮提取量的响应面图(A)和等高线图(B)Fig.5 Response surface map (A) and contour map (B) of effect of extraction times and ratio of solid to liquid on the extraction amount of flavonoids from Hippophae rhamnoides Linn. powder

图6 乙醇浓度和提取次数对沙棘果粉黄酮提取量的响应面图(A)和等高线图(B)

通过三维响应面图和二维等高线图分析显示，随着乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数的增大或延长，沙棘果粉黄酮提取量也随之增大，但当乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数增大或延长到一定程度后，黄酮提取量有下降的趋势(见图5和图6)，提取次数和料液比、乙醇浓度和提取次数的交互作用对模型影响显著，其余均不显著，从等高线图中可以看出其椭圆程度和疏密程度，与模型回归中的方差分析一致。

2.4 最佳提取条件的确定

由响应面法试验分析数据可得出沙棘果粉中黄酮的最佳提取取工艺：乙醇浓度为77.4%，料液比为1∶24.46，提取时间为1.98 h，提取次数为2.38次，最佳提取量为2.22%。考虑实验室操作的可行性，修正提取工艺条件为乙醇浓度75%、料液比1∶25、提取时间2.0 h和提取次数2次。

2.5 优化条件的验证性试验

根据响应面试验筛选出沙棘果粉黄酮提取的最佳工艺(见2.4)，进行3组平行试验，验证响应面试验结果的可靠性和准确性。测得沙棘果粉黄酮得率，见表5。

表5 验证性试验测定沙棘果粉黄酮提取量Table 5 Confirmatory experiment for testing the extraction amount of flavonoids from Hippophae rhamnoides Linn. powder %

由表5可知，3组平行试验数据的RSD为2.34%，满足要求，得出该提取工艺沙棘果粉黄酮提取量较为稳定。

3 结论

由响应面试验结果及方差分析可知，索氏提取法提取沙棘黄酮的最佳工艺为：乙醇浓度为75%，料液比为1∶25，提取时间为2.0 h和提取次数为2次。影响程度为：乙醇浓度>提取次数>料液比>提取时间，乙醇浓度和提取次数对沙棘黄酮提取量影响极显著。相对标准偏差RSD较小(2.34%)，说明索氏提取法提取沙棘黄酮工艺精确、可靠。响应面试验能对各个因素及各因素之间的交互分析得更全面、更细致，能较为准确地分析出因素间的最佳组合，试验稳定、可靠，为今后研究沙棘果粉黄酮等成分的提取提供了试验依据。