响应面法优化海南眼树莲中三萜类化合物的提取工艺①

曾慧慧 樊自强 杨 莉 段永霞 叶 帆 杨 柳 余邦良

(海南医学院药学院 海南海口 571199)

眼树莲（Dischidia chinensis），别名瓜子金、瓜子藤、滴锡藤、石仙桃、小耳环、上树瓜子、树上瓜子、上树鳖、翼鱼草，为萝藦科眼树莲属附生藤本植物，生长在低海拔至中海拔的山地林谷或旷地，在中国主要产于海南、广东和广西等省区［1］。眼树莲全株入药，有清肺化痰、凉血解毒之功效，民间用于治疗肺燥咳痰、咳血、百日咳、小儿疳积、痢疾、疥疮毒脓、跌打肿痛、毒蛇咬伤［2］。海南黎族地区用其全草煮水熏眼，治疗眼疾［3］。霍丽妮等［4］研究了眼树莲全株中总酚和总黄酮的体外抗氧化活性。杨柳等［5-6］、洪家立等［7］、张天花等［8］发现海南产眼树莲不同提取物具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。余邦良等［9］首次从眼树莲乙酸乙酯中分离得到10 个单体化合物，大部分为萜类化合物，但是提取率较低。据文献［10-12］报道，萜类化合物具有一定抗肿瘤活性，目前未见关于应用响应面优化方法筛选眼树莲中三萜类化合物提取工艺的报道。

为了从眼树莲中获取更多量的三萜类化合物，探讨一种高效提取方法，前期通过对比索氏提取与超声提取2种实验方法，发现超声法提取眼树莲中三萜类化合物得率更高，因此选用超声波提取眼树莲中三萜类化合物。通过单因素和响应面法优化考察了各因素对提取得率的影响，期望建立一种快捷、简便、高效的眼树莲三萜类化合物提取方法，为深入开发利用眼树莲奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药材和试剂

眼树莲药材于2019 年3 月采自海南省海口市火山口地区，经海南大学刘寿柏副教授鉴定，其为萝藦科植物眼树莲，编号为YSL-201812；齐墩果酸，HPLC≥98.5%（上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇、香草醛、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯、二甲苯均为分析纯（广东西陇化工试剂有限公司）。

1.1.2 仪器

LC-15C 高效液相色谱仪（日本岛津）；722N可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；KQ5200E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；TG16-WS 台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；SSW-600-2S 电热恒温水浴箱（上海博迅实业有限公司）；DFY-1000D 药用粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；YRE-210D 型旋转蒸发器（巩义市予华仪器有限责任公司）；DHG-9095A 型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；C-YLS-Q4 型耳片打孔器（北京哲成科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品提取液的制备

采集新鲜的海南本地眼树莲，切段，晒干，用粉碎机粉碎，过40 目筛，获得3 kg 粉末；称取3.0 g眼树莲粉末，置于锥形瓶中，加入溶剂混匀，以不同的超声功率、温度、提取时间、液料比进行三萜类化合物的提取；超声时间到了之后，抽滤得到提取液，超声3次，合并滤液，备用［8］。

1.2.2 眼树莲中三萜类化合物的含量测定

1.2.2.1 齐墩果酸标准曲线的绘制

参考文献［8，13-14］的方法，精密称取齐墩果酸10.0 mg，以无水乙醇为溶剂，配制0.4 mg/mL 齐墩果酸溶液。量取0.2 mL 齐墩果酸溶液，于80℃水浴加热至溶剂挥发完毕，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.3 mL、高氯酸0.7 mL，摇匀；于70℃水浴加热15 min，冷却至室温，加入4 mL乙酸乙酯摇匀，即为齐墩果酸标准溶液；将齐墩果酸标准溶液采用逐级稀释法分别稀释为12.0、10.0、8.0、6.0、4.0 µg/mL 的系列标准溶液；以560 nm为扫描波长，以系列齐墩果酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制一条标准曲线，得到线性方程及相关系数。

1.2.2.2 计算三萜类化合物得率

将1.2.1中所得眼树莲的三萜类化合物提取液成倍稀释后，取稀释后溶液5 mL，用1.2.2.1方法测定其吸光度值，记录其吸光度值，根据以下公式，计算眼树莲三萜类化合物的得率［14］，用η表示。

式中：η，三萜类化合物得率；m，测得的吸光度在齐墩果酸标准曲线上显示的齐墩果酸（µg）；c，稀释倍数；M，样品质量（g）。

前期实验比较了多种溶剂的提取效果，发现将乙酸乙酯作为溶剂，提取眼树莲中三萜类化合物的得率较高，所以选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

1.2.3 单因素实验

以眼树莲中三萜类化合物得率为考察指标，对超声功率、提取温度、提取时间、液料比进行单因素实验，考察这4个因素对三萜类化合物得率的影响。分别精确称取3.0 g 眼树莲粉末5 份，分成5 个实验组，每个实验组均根据1.2.1 方法获取眼树莲中三萜类化合物提取液；每个实验组分别取3 份提取液，按照1.2.2 方法平行测定其三萜类化合物的得率，求其平均值［15］。在固定提取温度均为45℃，超声浸提时间均为30 min，液料比为30︰1（mL/g）的条件下，分别考察不同超声功率（100、150、200、250、300 W）对三萜类化合物提取得率的影响；再根据实验确定的功率条件，考察不同提取温度（40、45、50、55、60℃）对三萜类化合物提取得率的影响；随后分别考察不同超声提取时间（20、30、40、50、60 min）、不同液料比 （10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）对三萜类化合物提取得率的影响。

1.2.4 响应面优化实验设计

基于单因素实验，选用Design Expert 11 软件，根据Box-Behnken 模型的实验设计原理，以眼树莲中三萜类化合物得率为响应值，选择超声功率（A）、温度（B）、时间（C）、液料比（D）4 个因素进行响应面实验，平行测定3次，求眼树莲中三萜类化合物平均得率，筛选出最佳提取工艺条件［16］。响应面优化实验因素和水平见表1。

表1 眼树莲中三萜类化合物响应面因素和水平表

1.2.5 实验条件对比

分别采用响应面优化后的实验条件（1#）与张天花等［8］优化后的实验条件（2#）来提取眼树莲三萜类化合物，以得率为考察因素进行对比。

1.2.6 液相色谱鉴别［17］

1.2.6.1 色谱条件

Kromasil C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相为甲醇∶0.2%磷酸水溶液（87∶13）；流速1.0 mL/min；检测波长210 nm；柱温为室温；进样量为20µL。

1.2.6.2 供试品溶液的制备

采用响应面优化后的实验条件（1#）与张天花等［8］优化后的实验条件（2#），获得眼树莲三萜类化合物，分别将其浓缩成浸膏，并用HPLC 级甲醇将其超声溶解成2.00 mg/mL 的溶液，取上清液经0.22 µm 滤膜过滤后，作为供试品溶液A，供试品溶液B。

1.2.6.3 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸20 mg 置于10 mL 容量瓶中，并用HPLC 级甲醇将其溶解成2.00 mg/mL 的齐墩果酸溶液，作为对照品溶液。

1.2.7 抗炎活性实验

根据单因素实验和响应面优化实验结果确定较好的一组提取工艺，用杨柳等［5］的“二甲苯所致小鼠耳肿胀抗炎模型”方法，考察三萜类化合物的抗炎活性。取30 只雄性昆明种小鼠，分3 组，每组各10只；以48 mg/kg给药剂量，作为药物组；以1%的羧甲基纤维素水溶液作为空白对照组；以500 mg/kg 阿司匹林给药剂量，作为阳性药物组。参照杨柳等［5］的方法，计算三萜类化合物的的耳肿胀抑制率。

1.2.8 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2016 作图， SPSS19.0统计软件进行数据统计，以p＜0.05为差异有统计学意义，采用Design-Expert 11 进行响应面优化设计。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

绘制标准曲线实验结果表明，标准曲线线性方程为y＝0.022 4x＋0.063 8，R²＝0.999 5。经回归分析可知，在4.0～12.0 µg/mL 浓度范围内，齐墩果酸标准浓度与吸光度呈良好的线性关系，可用于计算三萜类化合物的得率。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声功率对三萜类化合物得率的影响

由图1 可知，超声功率在200 W 以下，随着提取功率的增加，三萜类化合物的得率也增大，至200 W 时三萜类化合物的得率达到最大值；功率为250 W 时，眼树莲中三萜类化合物的得率呈下降趋势。可能是因为超声功率在200 W 时，超声波的空化作用与机械作用达到较好的结合点，眼树莲中三萜类化合物完全溶出［14］，故超声功率选择200 W为宜。

2.2.2 温度对三萜类化合物得率的影响

由图2 可知，超声温度＜55℃时，三萜类化合物得率随着温度升高而逐渐增加；超声温度＞55℃时，三萜类化合物得率有所下降。这是因为随着提取温度的上升，介质扩散速率加速，分子运动剧烈增加，有利于提升三萜类化合物的得率［18-19］。但温度过高，会影响三萜类化合物结构的稳定性，从而导致得率下降［20］，故选择提取温度为55℃。

2.2.3 超声提取时间对三萜类化合物得率的影响

由图3可知，提取时间对眼树莲三萜类化合物的得率有一定影响。30 min时三萜类化合物的得率提高比较明显，40 min时三萜类化合物得率达到最大值（14.53 mg/g），随后三萜类化合物的得率不断下降。由于刚开始物料与溶剂的接触越来越充分，因此得率逐渐增加，但随时间的延长，杂质的溶出增加，这可能降低了浸提速度［13-14］，因此选择超声提取时间40 min为宜。

2.2.4 液料比对眼树莲三萜类化合物得率的影响

由图4可知，液料比对眼树莲三萜类化合物得率具有一定的影响。随着液料比的增加，三萜类化合物得率呈先上升后下降的趋势，当液料比达到30∶1（mL/g）时，眼树莲中三萜类化合物得率达到最高。前期由于液料比过低，料液粘稠增加，超声波空化作用减小，不利于超声波在溶剂中的传播扩散［21］，所以随着液料比的增加，眼树莲中三萜类化合物得率有所提高。但是液料比过大也会使溶剂和能耗增加，从而造成浪费，并增加下一步浓缩工序的难度［8，14，22］，故选择提取液料比为30∶1（mL/g）。

2.3 响应面优化实验结果

2.3.1 响应面模型建立与显著性分析

基于单因素实验结果，运用响应面法优化眼树莲三萜类化合物提取工艺［15］，响应面优化实验结果见表2。利用Design-Expert11 软件对实验所得数据进行回归分析，获得以超声功率（A）、温度（B）、时间（C）、液料比（D）为因素水平，以眼树莲中三萜类化合物得率为评价指标（Y）的二次多项回归方程式：Y＝20.736＋1.87A－1.77B＋1.49C＋1.38D－0.982 5AB＋0.422 5AC＋1.51AD－0.547 5BC＋1.06BD＋0.955 0CD－2.82A²－3.05B²－2.06C²－3.15D²

表2 响应面优化实验结果

利用方差分析进一步验证模型的可靠性，实验结果见表3。模型p值＜0.000 1，表明方程模型极其显著，失拟项p值＞0.05，表明失拟不显著，说明模型拟合程度较好［23-24］。用R2决定系数和R2Adj调整决定系数来检查方程的拟合程度。实验真实值与模型预测值的决定系数R2＝0.966 5、调整决定系数说明该模型拟合程度良好，可靠性较高，实验值与预测值之间具有较高的关联性［25］，可以利用该模型预测眼树莲三萜类化合物的最高得率；在所考察的独立因素、因素间交互项及因素的二次项中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D²对眼树莲三萜类化合物得率影响极其显著（p＜0.01），AB、AD、BD、CD对眼树莲三萜类化合物得率影响显著（p＜0.05），这些因素对三萜类化合物得率影响较大，具有统计学意义，故认为4个因素不仅其简单的线性关系影响着得率，而且其交互项、二次项对得率均有一定的影响。方差分析表中各因素的F值反映因素对响应值的重要性，F值越大，表明对响应值的影响越大，重要性越大［26］。经分析可知，各因素对眼树莲三萜类化合物得率影响程度大小顺序为超声功率（A）＞温度（B）＞时间（C）＞液料比（D）。

表3 以三萜类化合物得率为响应值回归模型方差分析

2.3.2 响应面交互作用分析及条件优化

曲面图和等高线图可以形象地反映响应值随各因素的变化趋势［26］。利用 Design-Expert11 软件对上述实验结果进行响应面分析，绘制出超声功率、温度、时间、液料比这4个因素之间的交互作用对三萜类化合物得率影响的响应面，可以得到该模型的响应面图和等高线图，见图5。响应面图的曲面曲线走势越陡，表明两因素的交互作用越显著［27］。等高线为椭圆形表示两因素的交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著［28］。从图5可知，提取功率（A）与液料比（D）的等高线呈椭圆，且两者的响应面图形曲线走势较陡，说明这两因素对眼树莲三萜类化合物的得率影响极其显著；提取功率（A）与提取温度（B）、提取温度（B）与液料比（D）、提取时间（C）与液料比（D）的等高线趋近于椭圆形，说明两因素间交互作用对三萜类化合物得率影响显著；提取功率（A）与提取时间（C）、提取温度（B）与提取时间（C）的等高线均趋向圆形，说明两个因素间的交互作用对三萜类化合物得率影响不显著。以上响应面图形分析结果与方差分析（表3）相符合。根据建立的模型进行参数优化分析，以得率的最高值为优化目标，得最优工艺为：超声功率225.57 W、温度48.25℃、时间45.23 min、液料比23.55∶1（mL/g）。根据实验条件进行修正：超声功率225 W、温度48℃、时间46 min、液料比为23∶1（mL/g），并按照响应面优化后的条件采用含量测定方法进行验证实验，实验结果见表4，所得得率平均值为22.12 mg/g，RSD为0.3%，预测值22.20 mg/g，预测值与实际值误差较小，说明响应面优化模型可靠，结果表明该实验条件具有重现性、可控性。

表4 眼树莲中三萜类化合物验证实验结果

2.4 条件对比实验结果

分别利用响应面优化后的实验条件（1#）与张天花等［8］优化后的实验条件（2#）提取三萜类化合物，2种方法的得率大小对比实验结果见表5。结果表明，响应面优化的实验条件得率较高，实验温度条件较为温和。

表5 两种种实验条件提取三萜类化合物的得率比较结果

2.5 高效液相色谱鉴别结果

分别将1#和2#工艺提取得到眼树莲中三萜类化合物及齐墩果酸按照1.2.6.1的实验条件进行液相色谱测定，液相色谱图见图6。从图6 可知其均含有相同出峰时间的物质，说明眼树莲中含有三萜类提取物。

2.6 抗炎活性实验结果

实验结果见表6。眼树莲中三萜类化合物能够抑制小鼠耳肿胀，与空白对照组比较，耳肿胀抑制率为69.1%，说明眼树莲中三萜类化合物具有抗炎活性。

3 讨论与结论

3.1 讨论

目前，关于植物三萜类化合物提取工艺的研究报道较多［14-16，18，21-23］，但对眼树莲三萜类化合物提取工艺的研究较少。李志等［14］采用超声波辅助法对薏苡仁中三萜化合物提取工艺进行研究发现，该方法得率较高，且设备简单。苏元元等［16］采用Box-Benhnken 响应面分析法通过优化获得简单、高效的提取夏枯草中三萜类化合物工艺。吕苏珊［29］采用Box-Benhnken 响应面分析法优化萝藦科黑骨藤皂苷类成分提取工艺，得到相关可靠参数。综上研究可以看出，萝藦科眼树莲三萜类化合物提取工艺可采用超声波辅助提取及Box-Benhnken响应面分析法优化。响应面分析是通过设计合理实验的方法，运用多元二次回归方程来拟合因素和响应值的关系，寻找最佳响应值的统计方法［30］。响应面分析法与传统的正交设计相比，既能体现提取过程中不同因素之间的交互作用关系，又能更加精确地筛选出最佳提取工艺，对于非线性响应因素的预测具有较强的指导性，应用价值

较高［31］。

表6 眼树莲中三萜类化合物抗炎活性实验结果

3.2 结论

本研究在单因素的基础上，选择对三萜类化合物得率影响较大的因素，通过响应面分析法对眼树莲三萜类化合物提取工艺进行优化，最后确定其最佳提取工艺：超声功率225 W、温度48℃、时间46 min、液料比为23∶1（mL/g），在此条件下，眼树莲的三萜类化合物得率可达到22.12 mg/g，得率明显高于张天花等［8］用正交法优化的条件。获取的三萜类化合物经高效液相色谱鉴定可知其含有三萜类物质，通过小鼠耳肿胀实验可知其具有一定抗炎活性。本研究结果说明该工艺具有较好的应用价值，为深入研究眼树莲提供一定的参考价值和理论依据。