CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用进展

廖芳 王光银

摘要：CRISPR/Cas9基因编辑技术属于一种基于古细胞抵御外源核算入侵的免疫机制为基础开发出来的一种新型基因编辑技术，相对于传统的基因编辑技术而言，CRISPR/Cas9基因编辑技术具备操作简单、效率高、细胞毒性小等优势。当前CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤的研究和治疗中已经有一定的应用。对此，本文简要分析CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用进展，希望能够为相关工作者提供理论帮助。

关键词：CRISPR/Cas9;基因编辑技术;肿瘤;应用进展

引言

恶性肿瘤一直以来都是临床中致死率最高的疾病，对于人们的生命安全危害显著。按照国家癌症中心发布的相关数据来看，我国恶性肿瘤每年新发病例在390万左右，每年死亡人数约为230万，并且癌症负担也在不断提升，涨幅在3.9%左右，死亡率涨幅在2.5%左右，对于社会的危害显著。恶性肿瘤主要是因为遗传、环境以及机体免疫等方面的因素共同作用而引发，发病机制比较复杂，目前并不明确。另外，恶性肿瘤的治疗主要是一放化疗、手术治疗为主，但是对于放化疗的不耐受、晚期患者仍然没有有效的治疗方式，这也是恶性肿瘤患者治愈率不高的主要原因。对此，探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究和治疗中的应用进展具备显著实践性价值。

1.CRISPR/Cas9基因编辑技术

按照核酸内切酶的识别和切割机制的差异，CRISPR/Cas系统可以划分为2类5型，其中涉及到16个亚型。CRISPRRNA、反式激活CRISPRRNA、Cas9蛋白系统属于CRISPR/Cas9基因编辑技术的主要构成元素，在外源性DNA第一次入侵噬菌体和细胞时，CRISPR/Cas9系統会特异性的捕获外缘DNA序列，此时会整合到细菌CIRSPR序列中并形成目标位点下游的建个序列邻近基序[1]。同一个外缘DNA在第二次进入到细菌时，CRISPR/Cas9转录生成前提CRISPRNRA，在RNaseIII的作用之下，可以被加工成为成熟的crRNA。crRNA的3′可以借助碱基互补的方式配对，引导Cas9蛋白快速聚集并形成CRISPR核糖核蛋白复合体。复合体当中crRNA的5′末端特异性识别目标序列，同时还能够识别PAM的NGG位点。DNA在自我修复期间会优先应用容易失误的非同源末端连接，错误的使用碱基促使DAN发生图阿扁，从而完成基因敲除目标。在切割期间，PAM位点属于识别位点，同时PAM位点还可以区别自身DNA和外缘性DNA，预防自身买内衣的识别位点。伴随着临床研究的持续深入，研究人员开始应用单链导向RNA替代crRNA和tracrRNA并形成R环，同时实现Cas9蛋白对于目标基因的定点切割。

2.CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究和治疗中的应用

2.1肿瘤研究

在肿瘤的研究进程当中，应用离题细胞培养的方式实现对肿瘤发病机制的研究非常重要。CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用可以为研究者提供一个更加快捷且方便的肿瘤细胞系的分析支持[2]。在早期的相关研究当中，研究者主要是应用Cas9蛋白实现对DNA的靶切除，DNA双链在断裂之后会出现两种不同的修复表现，分别为同源末端连接方式与非同源末端连接方式，其中非同源末端连接方式修复之后会出现插入与缺失突变的表现，此时会导致DNA双链发生移码突变或无意义突变，从而形成基因敲除的目标。某研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术表达载体实现对神经胶质癌细胞的敲除分析，并呈现出高表达的Pyk2，实现对胶质瘤细胞的增值、迁移以及侵袭的表现，所以也证明了CRISPR/Cas9基因编辑技术对于胶质瘤的发生与发展影响，有望成为胶质瘤的治疗新方向。为了更好的明确CRISPR/Cas9基因编辑技术的有效性，在拓展CRISPR/Cas9系统其它方面的应用方面，近些年有研究发现了Cas9蛋白的突变体属于一种丧失了核酸酶祸心的Cas9蛋白，借助和DNA序列的结合可以实现对转录过程的抑制，从而实现对基因表达的抑制性影响。这一种表现主要是以dCas9的CRISPR系统别称为CRISPR干扰技术。该技术主要功能在于两个方面，一方民事dCas9的介导抑制作用，另一方面是介导激活作用。应用两种功能可以为研究人员提供敲除基因和探究基因功能的支持，可以借助dCas9实现激活技术筛选以及鉴定原癌基因的表达，有利于新基因治疗靶点的研究，可以作为未来肿瘤机制研究的重要方向。

2.2肿瘤治疗

在基因修复和敲除方面，肿瘤细胞形成过程中原癌基因的激活和抑制基因的沉默均可以导致肿瘤的发生，在恢复与提升抑癌基因表达方面便成为了治疗肿瘤的一个新思路。慢性髓系白血病的发生经常和体内抑癌基因的突变相关，同时也是决定患者预后效果的关键。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以实现对KBM5细胞当中ASXLI的无效突变修复影响，从而实现对KBM5细胞的增值速率控制，提升细胞的分化表现，并通过ASXLI基因修复实现对癌症小鼠生存时间的延长。另外，因为表观遗传学在肿瘤发生与发展过程中的重要影响，可以借助表观遗传学和CRISPR/Cas9基因编辑技术实现对肿瘤发生的影响，所以CRISPR/Cas9基因编辑技术也可能会成为肿瘤治疗的新手段。例如，在标贯遗传锈蚀和dCas9融合以及scRNA招募到目标位点方面，可以借助改变目标位点的甲基化状态并以特定方式实现对蛋白质的修饰性影响，从而实现肿瘤的治疗。

3.总结

综上所述，CRISPR/Cas9技术在肿瘤研究和治疗方面的应用价值显著，潜力明确。但是，在工作中必须意识到，CRISPR/Cas9技术仍然存在许多无法解决的问题，例如脱靶效应比较突出，在人体应用方面的伦理与安全性问题仍未解决。但是，可以明确CRISPR/Cas9想该技术不断发展的同时，必然可以解决各个方面的问题，从而有效应用于肿瘤的研究与治疗中，提供一个全新的干预路径，为患者的综合康复提供帮助。

参考文献：

[1]张骞，李力.CRISPR/Cas9基因编辑技术在妇科恶性肿瘤研究及治疗中应用的进展[J].中华妇产科杂志，2018，53（1）：65-70.

[2]汪超甲，王辉.CRISPR/cas9基因编辑系统的结构功能及其在脑胶质瘤中的应用进展[J].中国医药导报，2018，13（18）：244-245.

作者简介：廖芳（1992.12-）女，湖南涟源人，研究生，单位：娄底职业技术学院，研究方向：生物化学与分子生物学。