植物乳酸杆菌中的ADH的基因克隆

王思桐?刘光焱?李培峰

摘要：目的：探索醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase，ADH，EC1.1.1.1）在植物乳酸杆菌中的基因克隆。方法：通过引物设计、酶的基因克隆、诱导表达三个部分来进行醇脱氢酶的基因克隆工作。结果：1.通过在GeneBank中搜索相关醇脱氢酶基因，共计429条，利用Vector NTI软件进行同源比较，选取其中4条作为简并引物设计基因来源，设计一对简并引物。2.以植物乳酸杆菌Lactobacillus plantarum DNA为模板，PCR扩增出其中的醇脱氢酶基因ADH，分别构建表达质粒Pet-22b和Pet-28a，经IPTG诱导及SDS-PAGE电泳验证，表明在大肠杆菌DH5α中存在特异性条带，且大小相符。

关键词：植物乳酸杆菌;醇脱氢酶;PCR;诱导表达

醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase，ADH，EC1.1.1.1）的系统名为：醇：辅酶I氧化还原酶（Alcohol：NAD+，Oxidoreductase），大量存在于人和动物肝脏[1-2]、植物及微生物细胞之中。ADH可以催化非常多的内源性和外源性的有机底物的氧化反应，扮演着重要的生理学角色。

1.实验方法

①根据GeneBank上已发表的ADH基因序列设计简并引物。②将四种乳酸杆菌（植物、嗜酸、干酪、保加利亚）进行活化与培养，提取基因组DNA。③以四种乳酸杆菌基因组DNA 为模板进行PCR，并对PCR产物进行纯化。④提取质粒 pET-22b（+）/pET-28a（+），将质粒与目的片段进行酶切与连接。⑤E.coli BL21（DE3）感受态的制备与转化，进行阳性转化子筛选与鉴定。⑥工程菌的诱导表达及SDA-PAGE检测。

2.实验结果

2.1设计简并引物

根据GeneBank数据库，筛选出高保守醇脱氢酶基因序列进行简并引物的设计：

LP-ADH-001F：5-ATG AAA GCA GCA ACK TTT ATT G-3

LP-ADH-339R：5-G GTS RTT GTC AGT GAT ARA TAG-3

LP-ADH-088F：5-GGT TGT GGG CAC TGT GCC GCT TG-3

LP-ADH-256R：5-CC AAC AAC CGC ACC AGG ACG GCC-3

2.2从乳酸杆菌中克隆得到ADH基因

Agarose gel electrophoresis of ADH基因：1.植物乳酸杆菌;2.嗜酸乳酸杆菌;4.干酪乳酸杆菌;5保加利亚乳杆菌;7.植物乳酸杆菌中纯化后目的片段;10.11.12.The plastmids of ADH;13.The plastmids of pET-22b（+）;3，6，8，9：DL5000。

2.3工程菌的诱导表达与检测

2.4结果小结

利用PCR技术成功从植物乳酸杆菌中克隆得到ADH基因;克隆得到的基因成功连入原核表达载体pET-22b（+）并转化至E.coli BL21（DE3）中;工程菌通过IPTG诱导成功表达ADH基因。

3.讨论

目前ADH的研究中存在着结构资源有限、分子催化机理及手性识别规律尚不明晰、选择性和适用性局限以及輔酶再生限制等问题。本研究以来源于植物乳酸杆菌的醇脱氢酶作为研究对象，通过分子生物学手段，克隆获得醇脱氢酶基因并实现高效表达，以期大量获得ADH，可以更加方便和大量得获得单一的成分，然后对后续对其进行系统研究、找到活性、立体选择性高的酶及更好的应用提供依据，以便我们后续对酶进行修饰与改造。

参考文献：

[1]潘玲.枳黄方对酒精性肝损伤大鼠肝胃脂质过氧化水平、肝乙醇脱氢酶ADH_1 mRNA的表达及NF-B、COX-2表达的影响[D].华中科技大学，2006.

[2]周宁.酒精性肝病发生发展的基因组学和蛋白质组学研究[D].浙江大学，2013.

通讯作者：刘光焱