雄激素受体可变剪接异变体7 与前列腺癌关系的研究进展
2020-10-21于冰冰李扬邵晨
于冰冰,李扬,邵晨
(吉林大学基础医学院病理生理学系,吉林 长春 130021)
前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性生殖系统常见的恶性肿瘤,在世界范围内,PCa 发病率在所有男性恶性肿瘤中位居第2 位,2018 年全世界约有36 万人死于PCa 相关疾病,是全球男性肿瘤死亡的第五大原因[1]。近年来,随着我国人口老龄化和生活方式的改变,PCa 患者的发病率和死亡率呈明显上升趋势,已成为影响我国男性健康的重要疾病之一。由于早期PCa 常无症状,与欧美发达国家比较,我国对PCa 易感人群的筛查工作相对落后,初诊患者晚期PCa 比例更高[2-4]。
目前,PCa 的治疗手段主要包括PCa 根治术、放射治疗、全身化疗和雄激素阻断治疗(androgen deprivation therapies,ADT)等[5]。ADT 是转移性PCa 的标准治疗方法,是通过抑制雄激素分泌和拮抗雄激素受体(androgen receptor,AR)的作用阻断AR 转录,包括手术去势法和药物去势法[6]。由于PCa 存在雄激素依赖性,ADT 对多数PCa 患者早期治疗效果良好,可延缓激素敏感性PCa 进展,因此被作为临床上常规的PCa 治疗方式。然而,ADT 并不能治愈PCa,在经历18~24 个月有效期后,几乎所有患者均会发生激素抵抗并产生耐药性,逐渐且不可逆地演变为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC),并且多数患者伴有骨转移以及远处脏器转移[7]。CRPC 是指PCa 患者经过初次持续ADT 治疗后,血清睾酮水平达到去势水平(<1.7 nmol·L-1),但疾病依然进展的PCa。CRPC 表现为雄激素非依赖性,并且恶性程度更高,是导致临床治疗失败和患者死亡的主要原因。
虽然CRPC 患者雄激素合成被阻断,但多数CRPC 患者仍可表达AR,AR 信号通路异常激活是促进癌细胞生存和生长的决定性因素[8]。研究[9]显示:雄激素受体可变剪接异变体7(androgen receptor splice variant 7,AR-V7)在CRPC 肿瘤细胞和组织中表达水平较高,AR-V7 阳性患者预后较差。近年来研究[10]表明:AR-V7 在PCa 对紫杉烷类及AR 靶向药物耐药性的形成过程中具有促进作用,但是AR-V7 诱导PCa 细胞耐药性产生的具体分子机制尚不清楚。现就AR-V7 在CRPC 发生发展和耐药过程中的作用,探讨AR-V7 诱导PCa 细胞耐药的分子机制,为AR-V7 作为CRPC诊断及预后生物标志物和治疗新靶点提供理论依据。
1 AR 的结构和功能
AR 属于类固醇激素受体超家族中的一员,是存在于正常前列腺组织中的一种配体依赖性转录调节因子,可调控其下游基因的表达。正常情况下,AR 与5α-双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)和睾酮结合是男性性别分化及发育的先决条件,AR 在细胞核中与其下游基因,如前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)和跨膜丝氨酸蛋白酶 2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)的启动子结合,募集多种转录共调节因子,维持细胞生长和存活[11]。但是,AR 同时也存在于PCa 细胞中,在PCa 的发生发展过程中发挥重要作用。全长AR(full-length androgen receptor,AR-FL)由4 个结构域构成(图1)[8,11-12]:①具有独立转录活化功能的氨基端结构域(N-terminal domain,NTD),为外显子1 编码,转录共调节因子可与其特异性结合位点结合,缺乏LBD 或雄激素时可激活靶基因的转录,在AR 转录活化中起关键作用。②高度保守的DNA 结合结构域(DNAbinding domain,DBD),为外显子2 和3 编码,其作为特异性碱基的结合位点可识别靶基因中的雄激素反应元件(androgen response elements,AREs),与靶基因结合并控制其表达。③配体结合结构域(ligand-binding domain,LBD),为外显子4~8 编码,雄激素与AR 结合的位点,负责激素识别并保证信号传导途径的特异性和选择性。④连接DBD 和LBD 的铰链区(hinge domain,HD),为外显子4 编码,包含核定位信号(nuclear localization signal,NLS),能够介导AR 核转运以及调节AR 与DNA 结合、共活化因子的募集以及AR 的N-C 二聚化。当雄激素与AR 的LBD 在细胞质结合后,AR 结构发生改变,AR 的NTD 与LBD通过N-C 端相互作用进行分子内二聚化,导致铰链区的NLS 暴露,在核转运子的协助下从细胞质转移到细胞核。激活后AR 的DBD 可与雄激素反应元件(AREs)结合,诱导转录复合物的组装,调控包括 PSA、TMPRSS2 和己糖激酶 2(hexokinase 2,HK2)在内的下游基因表达,促进PCa 的发生发展和转移。
图1 AR-FL 和AR-V7 结构示意图Fig.1 Structure diagram of AR-FL and AR-V7
2 AR 信号通路的异常激活机制
在雄激素耗尽的情况下AR 仍可被激活。在CRPC 中尽管雄激素水平被抑制,但AR 信号通路异常激活在CRPC 中仍起着至关重要的作用。目前AR 异常激活主要包括以下几种途径:①AR 基因扩增。CRPC 的发展与AR 基因扩增或其他机制导致的AR 表达增加有关,但AR 基因扩增并不是AR信号通路异常激活的主要原因[13]。②AR 基因突变。多数已检测到的突变位于LBD,可导致AR 雄激素非依赖性激活,这也是ADT 后PCa 细胞产生抗性的原因之一。研究[14]表明:雄激素缺乏或抗雄激素的药物存在是AR 基因突变的选择压力,用AR 靶向药物治疗可增加AR 基因突变的发生率。③AR 的翻译后修饰。在ADT 期间持续激活的AR转录活性可能是AR 翻译后磷酸化修饰所致。研究[15]显示:Src 基因(sarcoma gene)诱导AR 的Y534 位点磷酸化可导致AR 对低水平雄激素敏感和AR 的雄激素非依赖性激活。上皮和内皮酪氨酸激酶(epithelial and endothelial tyrosine kinase,Etk)作为非受体型酪氨酸激酶和Src 与磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的下游效应物,其表达在ADT 期间明显上调,并能够通过在Y534 和Y551/Y552 位点磷酸化AR 从而稳定AR 并在无雄激素时促进AR 活性[12]。④AR 共激活因子过表达。染色质免疫沉淀实验结果显示:在CRPC 细胞中AR 共激活因子MED1 和AR 协作因子FoxA1、GATA2 活性增强,而沉默这些因子可使AR 下游基因(UBE2C)表达水平降低。白细胞介素6 介导的核受体辅激活因子1(NCoA1 或Src1)的磷酸化以配体非依赖性方式促进AR 转录,而且丝裂原活化蛋白激酶(mitogenic activated protein kinase,MAPK)介导的该共激活因子的磷酸化可能增加AR 与雄激素的亲和性,导致疾病复发和CRPC 的进展[16]。⑤AR 可变剪接异变体(androgen receptor splice variants,ARVs)的表达。2008 年以来,研究者在转移性PCa 中陆续发现了20 多种ARVs。ARVs 表达是AR 持续激活、PCa 细胞生存以及ADT 后疾病进展的重要机制之一[16]。随着相关研究的不断深入,研究者认为ARVs 的发现具有重要的临床意义,ARVs 表达水平与肿瘤进展加速和生存期较短有密切关联,且可能作为预测PCa 患者预后的标志物[17]。多数ARVs 缺乏LBD,即使在没有配体的情况下,也具有转录活性。AR 活性受到ARVs 调控:ARVs 活化导致类固醇生成酶上调,可为AR 提供更多配体;同时,ARVs 可增加AR 调节基因的表达,导致AR 信号通路在配体缺失条件下异常激活[18]。虽然在PCa 细胞中通过雄激素拮抗剂抑制LBD 可增加ARVs 的表达,但ARVs 表达的调控机制尚不清楚。
3 PCa 中ARVs 的产生及结构
ARVs 最早发现于21 世纪初期,不同的研究团队在PCa 细胞系(22Rv1、VCaP 和CWR-R1)、人异种移植物(LuCaP 86.2 和LuCaP 136)和临床PCa标本中共发现17种缺乏LBD 的ARVs[16]。良性前列腺组织中也可以检测到ARVs,但其在正常前列腺组织或细胞中的作用尚不清楚。ARVs 可能在驱动肿瘤起始中不发挥作用,但在ADT 期间驱动肿瘤进展中发挥作用。部分ARVs 具有组成型活性,在没有配体激活条件下即可表现出一定程度的活性,如AR-V7(也称为AR3)和ARv567es(也称为AR-V12)[17];而另一部分ARVs 则需要在配体激活条件下才具有活性,如AR-V1 和AR-V9。除AR45 的NTD 截短,其他变体均含有完整的NTD,但缺乏与雄激素结合的LBD。多数ARVs均含有完整的DBD,可以与靶基因结合,调控靶基因表达[13]。
ARVs 可能是体细胞无义突变、AR 基因中提前引入终止密码子、AR 基因重排或AR 蛋白翻译后水解的产物,上述遗传和表观遗传机制介导了ARVs 的产生[13,16]。ARVs 最明显的特征是缺乏编码LBD 的开放阅读框,可能是编码DBD 的外显子下游插入隐蔽外显子或编码C 末端结构域的外显子的缺失所致。缺乏LBD 的AR 同种型是PCa 进展的重要因素,其在CRPC 进展和针对该结构域的治疗中发挥重要作用。多数ARVs 保留NTD 与AF1 反式激活结构域和DBD,因此可组成性激活并且能够独立于配体维持基因转录。雄激素存在与否,ARVs 均定位于细胞核,导致AR 信号传导途径雄激素非依赖性激活。
在现已发现的ARVs 中,截短的变体AR-V7和外显子跳跃变体ARv567es 在PCa 中具有重要的临床意义,且两者均在原发性前列腺肿瘤和转移瘤中表达,主要区别是AR-V7 无HD,而ARv567es具有完整的HD[18]。ARv567es 和AR-V7 作为组成型活性受体,不依赖于LBD 即可增强AR 转录活性,促进AR-FL 表达,进而促进CRPC 进展[19]。研究[20-21]表明:在无雄激素的条件下,特异性敲低雄激素非依赖性细胞系22Rv1 和CWR-R1 中内源性AR-V7 和ARv567es 可抑制肿瘤细胞生长,恢复肿瘤细胞对雄激素和恩杂鲁胺的反应。此外,AR-V7 和ARv567es 的过表达可在雄激素依赖性LNCaP 细胞中驱动其在ADT 期间继续存活。由于AR-V7 是目前研究最多且是临床上检测到表达水平最高的ARVs,因此本文作者将以AR-V7 为核心探讨其与PCa 发生发展的关系。
4 AR-V7 与AR 的关系
目前尚未发现独立于AR 而单独存在的AR-V7,表达AR-V7 的PCa 细胞也同时表达AR-FL,但细胞表达AR-FL 不一定同时表达ARV7,因此比较AR-V7 与AR 的异同对分析AR-V7的功能尤其重要。AR 靶基因的激活需要AR 共调节蛋白和其他转录协同因子共同作用,因此AR 活性不仅由雄激素介导,还受AR 同源二聚体及其辅助因子的相互作用。研究[21]显示:AR-V7 也需要二聚化以发挥其转录活性。AR-V7 不仅可以同源二聚体化,还可以与AR 异二聚化,导致AR 的雄激素非依赖性核定位和转录活性。虽然AR-V7 与AR 存在许多重叠的靶基因,可以在特定条件下替代AR 调节下游基因的转录,但是AR 与AR-V7 分别介导不同的细胞周期基因表达谱,AR 主要调控与分子合成有关的基因,而AR-V7 可特异性增加包括UBE2C 在内的细胞周期相关基因的表达[22-23]。此外,AR-V7 还可以诱导上皮间质转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT),AR-V7的表达导致间充质标记物(N-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail 和Zeb1)上调[24-26],上述研究证明转移性PCa 标本中AR-V7 表达水平增加,表明AR-V7信号转导与EMT 之间存在关联,可能与PCa 的转移和治疗抗性有关联[27-28]。此外,AR-V7 可以促进AR 的核转移,并且协助AR 逃逸化疗药物对其核转移和信号通路的抑制作用,从而促进PCa 耐药性形成和CRPC 的进展。
5 AR-V7 与PCa 治疗
多烯紫杉醇(docetaxel)是第一种与转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer,mCRPC)生存获益相关的一线化疗药物,2004 年美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准以多烯紫杉醇为基础的化疗药物治疗mCRPC[29]。尽管PCa 患者应用多烯紫杉醇治疗后常会产生耐药性,但多烯紫杉醇仍然广泛应用于临床。多烯紫杉醇通过影响细胞周期,使肿瘤细胞阻滞在有丝分裂期(G2/M 期),诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长[30-32]。多烯紫杉醇治疗后,AR 信号仍然是PCa 生长的关键驱动因素。
鉴于AR 信号转导在促进晚期PCa 发展中的关键作用,AR 靶向药物被应用为多烯紫杉醇后CRPC 患者的主要用药,为PCa 的治疗提供了新思路。抑制雄激素合成和抑制雄激素与AR 结合的药物相继问世,现已经证实阿比特龙(abiraterone)和恩杂鲁胺(enzalutamide)可有效延长CRPC 患者的总生存率[33]。①阿比特龙:FDA 于2011 年批准阿比特龙用于治疗多烯紫杉醇治疗效果不佳的CRPC 患者,可延长患者总生存期(overall survival,OS)。阿比特龙不可逆地拮抗细胞色素P450 C17(cytochrome P450 17A1,CYP-17),CYP-17 是雄激素合成中具有裂解酶和17-α 羟化酶活性的关键酶,阿比特龙可阻断肾上腺、睾丸和前列腺中雄激素的合成,从而抑制PCa 细胞的生长。此外,阿比特龙还可通过抑制AR mRNA 的表达和降低AR 蛋白水平等阻断AR信号通路[17]。②恩杂鲁胺(MDV-3100):恩杂鲁胺于2012 年被FDA 批准用于治疗mCRPC,是一种新型AR 拮抗剂,与AR 具有高度亲和力,其通过与AR 的LBD结合,阻断雄激素与AR 的结合,进而抑制AR 的核转移、与DNA 的结合及其共激活物募集的能力,达到抑制AR 信号通路正常激活的作用,从而抑制PCa 细胞的生长和增殖,延缓PCa 的进展,可以作为紫杉醇治疗失败CRPC 患者的一线用药[7,9,17]。
尽管上述药物代表了CRPC 治疗上的突破,但几乎所有患者都不可避免地在1~2 年内产生耐药性。在PCa 组织中,AR 的增殖或突变可使其对低含量的雄激素敏感,从而导致PCa 的进展[7]。最近研究[14]显示:PCa 对阿比特龙和恩杂鲁胺的耐药性与ARVs 的表达有关。
5.1 AR-V7 与AR 靶向药物AR-V7 是PCa 中最常见、表达量最高的一种ARVs,主要定位于细胞核。采用RT-PCR 法检测AR-V7 mRNA 表达情况[12],结果显示:在CRPC 中AR-V7 mRNA 表达水平较正常组织增加约20 倍。在正常前列腺组织和早期PCa 细胞中AR-V7 蛋白表达水平极低,并且其表达水平随着疾病进展而增加。PCa 临床标本中AR-V7 mRNA 表达水平与蛋白表达水平间并不总是存在相关性,可能是由于使用了不准确的检测方法,或者一些潜在因素抑制AR-V7 mRNA 的表达。AR-V7 由连续剪接的AR 外显子1、2、3 及隐蔽外显子3(cryptic exon 3,CE3)编码,AR-V7具有完整的NTD 和DBD,但缺乏LBD 和HD,并由一段短肽序列代替。AR 的NLS 位于HD,但AR-V7 缺乏HD,NLS 由CE3 编码,这种特殊结构使其持续活化,在无配体结合状态下完成核转运并激活AR 信号通路,招募辅助因子完成下游基因的转录激活。由于AR-V7 缺乏LBD,传统的ADT药物阿比特龙和恩杂鲁胺均通过该区域发挥抑制作用,因此AR-V7 在协助PCa 细胞逃避恩杂鲁胺和阿比特龙等药物对AR 信号通路的抑制效应方面起着决定性作用,从而导致PCa 耐药性和CRPC 的进展[17,19,34]。ADT 期间低水平雄激素的刺激以及广泛应用AR 靶向药物,导致AR-V7 持续激活,从而导致CRPC 复发和耐药性的产生。
2014 年ANTONARAKIS 等[19]研究表明:CRPC 患者循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)中AR-V7 mRNA 表达水平与恩杂鲁胺和阿比特龙的耐药性有关。与AR-V7 阴性患者比较,AR-V7 阳性患者PSA 反应率明显降低,PSA 无进展生存期(PSA progression-free survival,PSAPFS)较短,临床或影像学无进展生存期较短[35]。在临床实践中,AR-V7 在PCa 细胞对AR 靶向药物耐药性中的具有重要作用,可预测下一代AR 靶向药物的抗性,故AR-V7 可作为CRPC 预后不良的生物标志物。由于AR-V7 可能参与AR 靶向药物潜在逃逸过程,研究人员正在开发新的试图通过识别和阻断AR-V7 的AR 拮抗剂(EPI-001、ARN-509、VT-464、AZD3514 和ODM-201)。
AR-V7 与PCa 的发展存在密切关联,AR-V7转录后调控也逐渐成为PCa 治疗中的重要环节[36],其中包括增加 PCa 中 AR-V7 蛋白降解。Galeterone 可诱导AR 和AR-V7 蛋白的降解,抑制CRPC 的进展;白藜芦醇可以促进AR-V7 的降解。氯硝柳胺也可明显下调AR-V7 蛋白水平。但目前对AR-V7 转录后调控模式的了解有限,仍需进一步探索。
5.2 AR-V7 与多烯紫杉醇多烯紫杉醇是广泛用于mCRPC 的一线治疗,属于紫衫烷类化疗药物。多烯紫杉醇可与β-微管蛋白结合而减少其解聚作用,通过稳定微管和抑制微管动力阻碍有丝分裂纺锤体形成,并持续激活纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,SAC),从而导致有丝分裂阻滞并最终导致细胞死亡[29,37]。近年来研究[38]表明:在多种PCa 细胞中,AR 活性与PCa 细胞对多烯紫杉醇的敏感性呈负相关关系,多烯紫杉醇主要通过干扰微管阻碍转录因子AR 入核,从而抑制AR 下游促生长基因(PSA 等)的表达发挥抑制细胞生长的作用。KUMORA 等[39]通过对比不同PCa 细胞中AR 活性和多烯紫杉醇敏感性的差异发现: AR 通路异常激活促进了多烯紫杉醇耐药性的发生。
HD 是AR 与微管相互作用的部位,AR-V7 无法与微管蛋白相互作用,核定位不受紫杉醇类药物的影响。AR-V7 可以通过激活AR 信号通路从而使PCa 细胞对多烯紫杉醇的敏感性降低,最终导致耐药性。研究[39-40]表明:高表达AR-V7 后,PCa 细胞对多烯紫杉醇敏感性降低。AR-V7 也可通过调控其下游基因进而降低多烯紫杉醇对PCa 细胞的杀伤作用,具体作用机制仍需继续探索。但是,许多临床实验结果并未证实AR-V7 在促进紫杉醇类药物耐受的作用。此外,AR-V7 阳性CRPC 患者接受紫杉烷治疗较AR 靶向治疗效果明显,而在AR-V7 阴性患者中,紫衫烷治疗效果与阿比特龙和恩杂鲁胺治疗效果无明显差异,提示AR-V7 的状态可能是选择 PCa 治疗方式的可靠指标[5,21,30]。AR-V7 与PCa 患者紫杉醇耐受间的关系仍需要更多样本的验证和后续的深入研究。
6 AR-V7 的临床应用评估
由于临床上缺乏对个体ARVs 的特异性抗体检测以及CRPC 相关的组织储存不足,导致在临床上验证ARVs 的作用受到一定程度的限制,但目前证据表明ARVs 可能是PCa 进展的促进因素。GUO 等[15]通过免疫组织化学方法评估了CRPC 和良性肿瘤样本中AR-V7 蛋白表达,结果显示:44%的CRPC 样本中AR-V7 蛋白呈阳性表达,而在良性肿瘤样本中AR-V7 蛋白呈阴性表达,并且AR-V7 高表达在根治性前列腺切除术后复发风险更高。研究[12,41]表明:AR-V7 阳性PCa 患者样本数量和AR-V7 mRNA 表达水平均随着PCa 进展而增加,并且AR-V7 mRNA 高水平表达的患者手术后中位PFS 和中位OS 较短,AR-V7 表达与PCa 患者预后不良和复发有密切关联。大量临床证据提示:AR-V7 表达在CRPC 进展及PCa 耐药性产生过程中具有重要作用。
7 小结及展望
随着PCa 发病率和死亡率的逐年升高,PCa 已经严重威胁中老年男性的健康。AR 信号通路在PCa 发生发展过程中具有重要作用,即使治疗初期ADT 可以在一定程度上缓解PCa 进展,但PCa 患者最终不可逆地发展为CRPC 以及产生耐药性,严重阻碍了PCa 的治疗效果。AR-V7 表达所导致的AR 信号通路异常激活,是促进CRPC 发展和产生耐药性的关键因素之一,虽然具体机制目前尚未完全阐明,但揭示AR 和AR-V7 的交互调控机制及差异将会为PCa 的治疗提供新的方向[31,33,42]。在今后的临床实践中可以通过检测晚期PCa 患者AR-V7 mRNA 和蛋白表达水平,选择个体化治疗方案。同时,随着临床样本量的扩大和细胞机制研究的深入,AR-V7 也可能作为预测PCa 进展以及对化疗药物敏感性的生物标志物[30,43-44]。