QuEChERS 结合高效液相色谱法快速检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留*

2020-10-21马春华陈文文

食品工程 2020年3期

马春华陈文文邢越

（武夷学院茶与食品学院，福建武夷山 354300）

氟喹诺酮类药是一类化学合成抗菌药，对于多种革兰阴性菌具有明显的杀菌效果。氟喹诺酮类药物是喹诺酮药物发展到第3 代的产物，对组织细胞的穿透力加强，因而吸收好，抗菌谱和杀菌效果强，作用范围广，在畜禽养殖业中应用广泛。氟喹诺酮类药主要包括恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星，恩诺沙星在动物体内代谢生成环丙沙星，在家禽体内残留形式以环丙沙星为主。随着氟喹诺酮类药物的广泛使用，细菌耐药和不良反应也相继发生。通过有效的分析技术，对动物性食品中的氟喹诺酮类药物残留进行检测，对于指导养殖业正确用药，确保动物性食品安全具有十分重要的意义。

药物残留的检测技术日益先进，常用的有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）、液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法及免疫法等。HPLC-MS 具有较高的灵敏度，但是由于仪器本身较昂贵，检测成本高，适合科研院所；而高效液相色谱仪建立的分析方法在实际工作中有较好的应用性与推广性。食品样品组成复杂，检测前需要采用合适的样品前处理方法，减少其他组分的干扰及基质的影响。目前，检测抗生素常用的前处理方法有液液萃取（LLE），基质固相分散（MSPD）、QuEChERS、结合固相萃取等方法。

国家标准规定恩诺沙星与环丙沙星之和，在禽肉和其他动物肌肉中的最大残留限量为100 μg/kg。本研究建立了一种QuEChERS-高效液相色谱快速测定鸡肉中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星3 种喹诺酮类兽药残留的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、药品与试剂

Agilent 1260 高效液相色谱仪，美国Agilent 有限公司；DN-12A 水浴氮吹仪，上海比朗仪器制造有限公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；涡旋混匀器，德国IKA 公司。依诺沙星（ENO）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）标准品，纯度＞99.0，北京百灵威科技有限公司。

N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）购自天津博纳艾尔杰公司。

标准贮备溶液：准确称取一定量的标准品，用甲醇溶解配成质量浓度为1.0 mg/mL 的溶液，4 ℃下避光保存。将各标准储备液用0.2%甲酸水溶液稀释，配成混合标准溶液。

1.2 样品前处理与净化

将鸡肉绞碎，称取2.0 g 置于50 mL 聚丙烯离心管中，加入2 mL 水，涡旋混匀后加入8 mL5%甲酸-乙腈溶液，涡旋30 s，再加入4 g 无水硫酸镁、1 g氯化钠，涡旋1 min 后，4 ℃的条件下8 000 r/min离心3 min，上清液全部转移至净化管，管中有50 mg PSA、150 mg C18，涡旋1 min，5 000 r/min 离心5 min。将上清液转移到10 mL 聚丙烯离心管中，45 ℃水浴氮吹仪吹干，用1 mL 10%乙腈水溶液（2%甲酸）复溶，用一次性无菌注射器吸取，过孔径0.45 μm 有机相滤膜，上机测定。

1.3 色谱条件

洗脱程序：0 min～3 min，85% A+15% B；3 min～6 min，75% A+25 % B ；6 min～7 min，67.5%A+32.5%B；7 min～8 min，60%A+40%B；8 min～13 min，85%A+15%B。

2 结果与讨论

2.1 分析条件的选择与优化

运用色谱柱分离氟喹诺酮抗生素时，采用酸性流动相有比较好的分离效果。在利用HPLC 分析氟喹诺酮类抗生素残留时，以乙腈为流动相常出现色谱峰拖尾等现象，当以乙腈-甲酸溶液为流动相，没有杂峰出现，分离效果较好。本研究采用乙腈和甲酸水溶液作为流动相，对比不同甲酸含量0.1%、0.2%和0.4%的分离效果，结果表明甲酸为0.2%时的出峰时间适中，峰形较好，峰面积最大，故选用0.2%甲酸水溶液（A 相） -乙腈（B 相）作为流动相。

2.2 提取条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化

GB/T 20366—2066《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定》中样品采用甲酸-乙腈提取，提取液用正己烷净化，旋转蒸发近干，氮气流吹干。

选择合适的提取剂很重要，对比乙腈、2%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈和EDTA-McIlvaine 的提取效果，比较同一浓度下已知样品中氟喹诺酮类抗生素的回收率，可以得出5%甲酸乙腈作为提取溶液时测定结果的回收率最好，2%甲酸乙腈次之，EDTAMcIlvaine 回收率最低，结果如下页图1 所示。

2.2.2 净化条件

查阅文献可知，QuEChERS 方法常用的脱水剂主要是无水硫酸镁、无水硫酸钠、柠檬酸钠、氯化钠等，常用吸附剂为十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）。经前期试验确定净化条件为：无水硫酸镁4.0 g、氯化钠1.0 g、C18用量150 mg、PSA 50 mg。

图1 不同溶剂萃取效果比较

2.3 方法验证

2.3.1 线性范围、检出限与定量限

按照1.2 处理得到质量浓度分别为1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg、100 μg/kg 的基质加标工作溶液，绘制各化合物的标准曲线，结果表明3 种喹诺酮类兽药浓度在1 μg/kg～100 μg/kg 线性关系良好，R2均大于0.99（表1）。在空白鸡肉样品中分别添加0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、4.0 μg/kg 的3 种氟喹诺酮混合标准溶液（n=5），经样品前处理后检测，以各化合物响应值大于3 倍信噪比（S/N）时对应的加标水平为方法检出限（LOD），10 倍信噪比为定量限，本方法检出限为0.3 μg/kg，方法定量限为1.0 μg/kg。

罗静等采用基质固相分散－液相色谱－串联质谱法检测鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留，检出限0.1 μg/kg；夏骏等采用QuEChERS-HPLC-MS 法测动物源性食品中氟喹诺酮类药物残留量，检出限2.0 ng/g～3.0 ng/g。本研究采用QuEChERS 技术对样品进行处理，分散固相萃取对样品净化，液相色谱进行检测，可以达到比较低的检测限，节省时间，对检测设备要求不高，可以满足日常检测的需要。

2.3.3 方法的精密度与准确度

称取2 g 绞碎混匀的鸡肉，然后向其添加2 种不同质量浓度的混合标准溶液（添加质量浓度为5.0 μg/mL、20.0 μg/mL），按本研究方法进行测定，计算出平均回收率为83.3%～112.0%，相对标准偏差（RSD）为3.2%～6.7%，结果如表2 所示。