液相色谱-质谱/质谱法测定牛乳中庆大霉素

程艳宇　张金环　刘正　闫磊

摘 要：建立了一种不使用离子对试剂测定牛奶样品中庆大霉素的液相色谱-质谱/质谱检验方法。样品经三氯乙酸溶液提取，然后在MCX固相萃取柱净化，使用HPLC-MS/MS多反应监测（MRM）模式进行定性、定量分析，净化液在高效液相色谱柱上以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱分离，质谱采集模式为电喷雾正离子监测模式。结果表明，庆大霉素各组分C1、C2+C2a、C1a在10～1 000、20～2 000、10～1 000 ng·mL-1范围内，峰面积与浓度线性良好，相关系数均>0.99;方法的检出限（LOD）分别为2.0、4.0、2.0 μg·kg-1，平均加标回收率达到63.2%～90.3%。该方法取消了传统方法的离子对试剂的使用，操作简便，满足对庆大霉素的定性和定量的要求，避免了离子对试剂对质谱的潜在影响。

关键词：氨基糖苷;庆大霉素;固相萃取;液相色谱-质谱/质谱法;离子对试剂

Abstract：A method was established for the determination of gentamicin in milk samples by HPLC-MS/MS without using ion pair reagents. The sample was extracted by trichloroacetic acid solution ，followed by MCX solid-phase extraction（SPE） as the cleanup procedure. High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry / Mass Spectrometry （HPLC-MS/MS） was used for identification and quantification of antibiotics. The separation was carried out on a CAPCELL PAK ST column with a gradient elution using 0.1% formic acid and acetonitrile. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode using multiple reaction ion monitoring （MRM） mode.The results showed that in the range of 10～1000， 20～2000 and 10～1 000 ng·ml-1， the peak area and concentration of gentamicin components C1，

C2 + C2a and C1a have good linearity， and the correlation coefficient is >0.99; The LOD is 2.0， 4.0 and 2.0 μg·kg-1 and the average recovery is 63.2%～90.3%. The method canceled the use of traditional ion pair reagents，which could protect the mass spectrometer avoiding contaminating. It is simple to operate and meets the qualitative and quantitative requirements of gentamicin.

Key words：Aminoglycosides; Gentamicin; Solid phase extraction; HPLC-MS/MS; Ion pairing agent

中圖分类号：R917

庆大霉素属氨基糖苷类抗生素，临床上常用其混合物的硫酸盐，主要有C1、C2、C1a和C2a共4种主要组分[1]，在畜禽养殖中作为兽药应用广泛，被用于治疗细菌感染。GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》对庆大霉素最高残留限量作了规定，在牛/猪肌肉或脂肪中为100 μg·kg-1，肝脏中为2 000 μg·kg-1，肾脏中为5 000 μg·kg-1，牛奶中为200 μg·kg-1，鸡/火鸡可食组织中为100 μg·kg-1。目前庆大霉素的检测方法有杯碟法[2]、液相色谱法[3]、酶联免疫法[4]、液相色谱-质谱/质谱法[5]等。液相色谱质谱联用技术的优势是分离效率高、分析速度快、灵敏度高，在很多领域都有广泛的应用[6]。庆大霉素结构中同时含有氨基和羟基，具有强极性，在提取和分离过程中常使用离子对试剂，如三氟乙酸[5]、七氟丁酸[7]等。但有报道称七氟丁酸会抑制质谱信号，尤其对质谱负离子扫描有影响，对质谱具有潜在的污染性[8]，降低负离子扫描的灵敏度，极大地限制了庆大霉素的检测实施范围。在探索离子对试剂替代的过程中，研究人员使用了高浓度的缓冲盐如甲酸铵作为流动相[9]，但缓冲盐使用不当易造成色谱柱中缓冲盐析出，影响柱效。本文重点探索不使用离子对试剂和高浓度缓冲盐，建立一种液质联用法检测牛乳中庆大霉素C1、C2+C2a、C1a的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱-质谱/质谱联用仪：岛津LC30A-MS/MS8050;冷冻离心机：湘仪TGL-20M;Milli-Q超纯水仪：MILLIPORE;N-EVAPTM111氮吹仪，美国Orgamonation公司;庆大霉素标准品，纯度90.8%（其中C1组分25.7%，C1a组分24.4%，C2+C2a组分50.0%），德国Dr.Ehrenstorfer;CAPCELL PAK ST色谱柱，2.0 mm×150 mm，三耀化工;MCX固相萃取柱，150 mg/6 mL，Waters公司;三氯乙酸、氨水均为分析纯;乙腈（Merk）、甲醇（Merk）和甲酸（CNW）均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 试验方法

（1）庆大霉素标准溶液配制。准确称取庆大霉素标准品11.0 mg（精确到0.1 mg），用水溶解并定容到100 mL，即为100 μg·mL-1标准品储备液，4 ℃避光保存，备用。吸取上述储备液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用水稀释并定容到10 mL，配制成10 μg·mL-1标准中间液。

（2）庆大霉素标准工作液的配制。精密量取标准中间液适量，用空白样品基质配制成不同浓度系列混合标准工作液（现用现配）。

（3）5%三氯乙酸的配制。称取三氯乙酸50 g，用水溶解并定容至1 L。

（4）15%氨水乙腈的配制。量取150 mL氨水，用乙腈稀释并定容至1 L。

（5）样品前处理。准确称取5 g（精确到0.01 g）试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入5%三氯乙酸溶液10 mL，均质2 min，在平板振荡器上振荡10 min，在高速冷冻离心机上离心5 min（10 000 r·min-1，4 ℃），离心上清液过滤至另一50 mL离心管。在残渣中再加入10 mL 5%三氯乙酸溶液，重复提取1次，合并上清液，准备过柱净化。取MCX固相萃取柱（依次用5 mL甲醇、5 mL水活化），将上述提取液加载在固相萃取柱上，控制流速约1 mL·min-1，然后用5 mL水，5 mL2%甲酸水，5 mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，抽干。最后用10 mL氨水∶乙腈（3∶17）洗脱至塑料离心管中，40 ℃水浴条件下用氮气挥发除去部分溶剂，用定容液定容至1.00 mL并涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜，供液相色谱-质谱/质谱测定。

1.3 液相色谱条件

色谱柱为CAPCELL PAK ST色谱柱（2.0 mm×

150 mm），柱温为35 ℃，进样量为2 μL;流动相A为0.1%甲酸，流动相B为乙腈，液相色谱梯度洗脱程序见表1。

1.4 质谱条件

离子源为电喷雾离子源;扫描方式为正离子扫描;检测方式为MRM多反应监测;雾化气流量为3 L·min-1;加热气流量为10 L·min-1;干燥气流量为10 L·min-1;接口温度为300 ℃，脱溶剂管温度为250 ℃，加热块温度为400 ℃，离子喷雾电压为4.1 kV。优化后的离子对及质谱电压参数等见表2，其中庆大霉素组分C2和C2a分子量相同，互为差向异构体[1]，色谱柱无法将其分开，故463.90>322.10反映C2和C2a两组分含量之和。

2 结果与分析

2.1 色谱柱选择

庆大霉素结构中含有氨基和其他碱性基团，同时含有多种亲水基团，极性强，在C18色谱柱上保留弱。国家标准方法检测庆大霉素使用C18反相色谱柱，为加强对庆大霉素的保留，使用七氟丁酸作为离子对试剂，为避免离子对试剂对质谱的潜在影响，本实验选用了2支亲水作用色谱柱ACQUITY UPLC BEH Hilic及CAPCELL PAK ST色谱柱，两个色谱柱均适用于分离强极性化合物[10]，分离模式为亲水作用色谱（Hilic）模式，按照Alpert[11]的Hilic模式理论，采用水和水溶性有机溶剂作为流动相，样品在色谱柱上的流出顺序与传统HPLC类似，极性越强保留越强，出峰越晚。使用流动相为0.1%甲酸、乙腈，通过调整流动相比例及流速，使庆大霉素在两支色谱柱上达到最好的分离效果。CAPCELL PAK ST色谱柱和BEH Hilic色谱柱分离庆大霉素的色谱图如图1、图2所示，由图可见，在0.4 mL·min-1流速条件下，庆大霉素在ST、BEH Hilic色谱柱上的保留时间分别为3.8 min、0.5 min，在ST色谱柱上的保留能力较BEH Hilic色谱柱强，且峰形较好，而在BEH Hilic色谱柱上响应信号较低，因此选择CAPCELL PAK ST色谱柱。

2.2 液相条件优化

2.2.1 流动相优化

在液相色谱中，流动相的pH对化合物的分离有很大影响，本实验比较了0.1%甲酸与1%甲酸流动相对庆大霉素在色谱柱上的保留能力，当甲酸提高到1%时，庆大霉素的保留能力减弱，出峰时间偏早

（1.6 min），响应面积降低，不利于庆大霉素的分离，因此选择0.1%甲酸、乙腈作为流动相，此时庆大霉素出峰时间为3.8 min。

2.2.2 定容液选择

在流动相确定的前提下，研究定容液对庆大霉素在色谱柱上分离的影响，选择了5种定容液，分别为0.1%甲酸+乙腈（2+3）、1%甲酸+乙腈（2+3）、1%甲酸+甲醇（2+3）、2%甲酸+甲醇（2+3）、5%甲酸+甲醇（2+3），將庆大霉素分别溶解在这5种定容液中，溶液浓度为1 μg·mL-1，进行仪器测定，比较庆大霉素的峰面积，结果如图3所示，可以看出，5%甲酸+甲醇（2+3）定容液对应的峰面积最高，因此选择5%甲酸+甲醇（2+3）作为庆大霉素检测的定容液。

2.2.3 进样容器选择

对氨基糖苷类药物的进样瓶容器，徐飞[12]的研究中使用塑料瓶，分析可能因为氨基糖苷类药物可与玻璃制品发生特异性吸附。试验对比了塑料进样瓶和玻璃进样瓶对庆大霉素响应的影响，采用1 μg·mL-1庆大霉素标准溶液，分别用塑料进样瓶和玻璃进样瓶盛放，然后将进样瓶中的标准溶液分别转移到新的塑料进样瓶和玻璃进样瓶中，如此依次转移至第4个进样瓶，在液质联用仪上测定，比较同一种进样瓶的第1个瓶和第4个瓶的响应面积，实验发现，塑料进样瓶对庆大霉素C1、C2+C2a、C1a的响应峰面积影响不大，但是玻璃进样瓶对庆大霉素的影响却比较大，转移到第4瓶，响应峰面积分别降低56.6%、53.9%、63.8%，因此选择塑料进样瓶作为庆大霉素进样容器（图4）。

2.3 净化方法优化