不同种类的植物精油体外抑菌效果观察

2020-10-20作者何楚俐胡豪井俊南黄静朱晓彤潘木水

广东饲料 2020年8期

◆作者：何楚俐胡豪井俊南黄静朱晓彤潘木水

◆单位：1.华南农业大学动物科学学院；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

集约化养殖过程中广泛使用抗生素来维持动物体的健康和提高生长性能。抗生素的过度使用，已引起细菌产生耐药性、药物残留、抗性基因污染等种种问题，并威胁到了人类自身的安全。1986年世界上第一个禁止将抗生素添加到畜禽饲料中的规定在瑞典实施，2006年欧盟亦开始全面禁止抗生素作为饲料添加剂使用。我国2020年药物饲料添加剂将全面退出养殖环节，因此养殖环节中寻求有效替代抗生素添加剂迫在眉睫。

植物精油是指从植物不同组织如果实、叶片、花和根中提取的具有强烈气味和香味的挥发性液体（Stanborough Tamsyn等，2018），植物精油可以抑制有害菌的生长繁殖，甚至直接杀死有害菌达到抗菌作用（李文茹，2016），具有良好的替代抗生素的潜力。研究表明，饲料中添加植物精油可以改善畜禽肉质、调节肠道菌群、提高免疫能力及生长速度等作用（DU E等，2016；Encun等，2016）。目前认为植物精油中的抗菌活性物质通过破坏细胞膜，促使细胞内容物的流失，最终完成杀灭细菌的任务（杨宝玲等，2019）。有研究也表明精油可以增强猪的生产性能和消化率（常娟等，2019），提高家禽的免疫力（常娟，2017）。此外，精油还具有减少炎症发生和抗氧化的作用，对肉鸡的健康生长起到了关键作用。

本实验选择了6种具有抑菌效果的植物精油：香芹酚、桂油、反式肉桂醛、肉桂醛、牛至油和丁香酚。通过抑菌圈法、最小抑菌浓度法（MIC），比较这6种植物精油对三种常见致病菌的抑菌效果，以期筛选出抑菌效果最佳的植物精油，为下一步开发植物精油替代抗生素的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

用于实验的6种植物精油分别是：桂油、牛至油、反式肉桂醛、肉桂醛、丁香酚和香芹酚，购于广州建阳生物科技有限公司；3种常见致病菌：大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，来自广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所微生物菌种保藏室。

1.1.2 试验仪器

压力蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、振荡器，电子天平等。

1.2 实验方法

1.2.1 适宜溶剂浓度的筛选

植物精油不溶于水，需要加入有机溶剂使其溶解。本实验选用乙醇作为植物精油的有机溶剂。但由于一定浓度的乙醇本身具有抑菌性，为了排除乙醇对实验结果的影响，设计40%、50%、60%、70%四个乙醇浓度用于筛选最适溶剂浓度。

1.2.2 菌株复苏及菌悬液的制备

将上述三种供试菌种进行斜面复苏，复苏后接种于固体培养基上，培养18h。直接从平板上挑取已纯化的单个菌落，混悬于制备好的液体培养基中，制成浓度为108CFU/mL的菌悬液，备用。

1.2.3 不同浓度乙醇的抑菌效果的测定

键盘模块采用动态扫描的方式，采用2个独立式键盘，分别用于控制显示环境温度和目标温度。按键S1用于控制显示环境温度，按键S2用于控制显示目标温度。其工作原理为：单片机通过运行程序不断扫描键盘，检查是否有键按下，当扫描到有键按下时，调用相关程序完成对应的操作。

用抑菌圈法（张卓然，1998）测定不同浓度的乙醇对三种致病菌的抑菌效果。首先利用倾注平板法将三种致病菌分别混于加热冷却至45℃的20mL LB培养基中，倒入已灭菌的9 cm培养皿中，冷却后打孔。将上面配制好的不同浓度乙醇溶液，加到已打好的孔内。放至恒温培养箱培养18～24h。观察结果。

1.2.4 不同植物精油体外抑菌效果的测定

用抑菌圈法测定6种植物精油的抑菌效果。首先从上述实验中选取最佳的乙醇浓度用作植物精油的溶剂。将三种致病菌分别混于加热冷却至45℃的20mL LB培养基中，利用倾注平板法倒入已干燥灭菌的直径9 cm培养皿中，冷却后采用琼脂平板孔洞法用无菌金属打孔器（d=4 mm）在培养皿上等距地打三个小孔，用镊子挑出孔内培养基后，每孔加入50μL已稀释的植物精油（1μL/mL），放至恒温培养箱培养18～24h。观察结果。

1.2.5 不同植物精油体外最小抑菌浓度（MIC）的测定

选取上述试验中抑菌效果最好的植物精油作为后续试验所用的植物精油。采用试管梯度稀释法测定最小抑菌浓度。取5支10mL的试管（编号1-5），每管加入相应的液体培养基3mL（1号管加入6mL液体培养基）。在1号管加入6μL植物精油，然后进行梯度稀释，使得1-5号管中最终植物精油范围为0.0625～1μL/mL。最后向每个试管中加入50μL菌悬液。同时设置对照组：只加培养基和菌液，不含精油。置于37℃下培养24h。培养结束后，如培养基浑浊，说明有菌生长；对于临界的透明试管，需要营养平板进行检验。将完全抑菌生长的最低植物精油浓度定义为最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 适宜溶剂浓度的筛选

实验过程中，稀释精油的乙醇浓度采用了以下四个浓度（40%、50%、60%、70%），实验结果表明：当乙醇的浓度小于等于50%时，对三种有害菌不产生抑菌效果。但考虑到乙醇具有挥发性，实验结果所得可能偏大。同时考虑到实验操作具有不确定性，故后续实验使用的乙醇浓度选定为40%。

2.2 不同植物精油体外抑菌效果的测定

表1 不同浓度乙醇的抑菌效果观察

图1 植物精油对三种致病菌的抑制作用

桂油对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，对大肠杆菌的效果弱于前者。牛至油和丁香酚对三种有害菌的抑菌效果依次为沙门氏菌＞大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌。反式肉桂醛和肉桂醛对三种有害菌的抑菌效果均比较接近。

表2 不同种类的植物精油对有害菌的抑菌效果观察（n=3）

表3 香芹酚对致病菌的最小抑菌浓度效果

图2 香芹酚对致病菌的最小抑菌浓度效果

香芹酚对三种有害菌的抑菌效果依次为大肠杆菌＞沙门氏菌＞金黄色葡萄球菌。

上述结果提示：实验中6种精油，香芹酚对三种有害菌的抑菌效果最好。

2.3 香芹酚对三种致病菌的最小抑菌浓度的结果

从表3和图2可以看出，香芹酚对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果为：第3试管生长浓度为0.25μL/mL，培养后清澈无菌；第4试管浑浊，即有菌生长。对临界的透明试管进行营养平板进行检验，结果发现无菌生长。所以香芹酚对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.25μL/mL。

3 讨论

本研究实验结果表明，植物精油对于革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌）与革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）均有较好的抑菌效果。王新伟等研究表明，香芹酚、牛至油、肉桂醛和柠檬醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。甘盈盈等(2019)研究香芹酚对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）（USA300）的抑菌效果，测得香芹酚的MIC为128～256μg/mL，与本实验结果相近。张修坤等（2019）的结果与本实验一致，香芹酚的抑菌效果较丁香酚的好。胡艳芬等发现香芹酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及猪霍乱沙门氏菌等常见病原菌有很好的抑制和杀灭作用。考虑到植物精油单独使用时的效果未能完全替代抗生素，许多学者研究了将植物精油复配或与其它抑菌分子联合起来使用的情况。张皓然等（2018）报道，植物精油与柠檬酸复合使用时具有协同作用，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制效果。王康莉等(2019)将植物精油进行复配，使用牛津杯法研究其抑菌效果，研究报道将肉桂醛与香兰素按照4：1进行复配时，对金黄色葡萄菌与沙门氏菌表现出最强的抑制效果。