红花多糖通过调控MMP-9抑制神经母细胞瘤侵袭、转移的研究

瞿红霞　高洁　张春泉　刘子龙　温娟　胡兆鹏

【摘 要】目的：研究红花多糖对神经母细胞瘤侵袭、转移的作用及其作用机制。方法：用不同浓度的红花多糖作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后进行细胞生物学功能实验，研究其对神经母细胞瘤侵袭及转移的影响;收集经不同浓度红花多糖处理的SH-SY5Y细胞的mRNA和蛋白分别进行RT–PCR和Westernblot实验。结果：红花多糖抑制神经母细胞瘤细胞的增殖、侵袭和转移;红花多糖在转录水平下调MMP-9的表达。结论：在神经母细胞瘤细胞中，红花多糖通过转录抑制下调MMP-9的表达，并通过靶向MMP-9抑制神经母细胞瘤细胞的体外侵袭、转移。

【关键词】红花多糖;神经母细胞瘤;MMP-9;SH-SY5Y;生物学功能

【中图分类号】R3【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2020）13--01

在临床上，红花常用于抗肿瘤复方中，大量的实验相继发现红花抑制肿瘤的主要成分为红花多糖（SPS）、红花黄色素及红花黄色素A，研究主要集中于肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤。将红花用于神经母细胞瘤的研究非常少，红花作用于该肿瘤的机理尚不明确。神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是起源于交感神经系统的恶性胎源性肿瘤。NB的病因目前并不明确，但目前越来越多的研究表明细胞外基质对肿瘤的侵袭和转移过程起组织屏障作用，细胞外基质屏障的破坏会使得肿瘤细胞发生侵袭和转移。

本研究观察了红花多糖对人神经母细胞瘤细胞株SH- SY5Y细胞的侵袭、转移、增殖的作用，并且对它的作用机理进行了初步探讨，为红花多糖治疗NB提供科学的实验和理论依据。

1 试剂与仪器

红花多糖购于成都德思特生物;人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y由华中科技大学同济医学院附属协和医院童教授提供;TRIPA总蛋白裂解液、MTT等购于武汉谷歌生物科技有限公司;ECL显影液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天公司;Transwell小室购自美国Invetrogen公司。DMEM细胞培养基、胎牛血清（FBS）等购于Hyclone公司;GAPDH和MMP-9基因的引物购至擎科生物;逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司-大连宝生物有限公司。兔抗MMP-9抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔的二抗购于ABclonal公司;生物超净台购自苏净安泰公司;PCR仪购自DTC公司。

2 方法

2.1 细胞培养及分组 SH-SY5Y细胞株在DMEM培养液中培养，37℃、5% CO2培养箱中培养。实验中所使用的SH-SY5Y细胞均处于对数生长期。待细胞融合至70～80%时，用胰酶消化，制备成细胞悬液并接种于细胞培养板中待细胞贴壁，生长良好后分别加入不同浓度的红花多糖。实验分为四组，其中第1组为对照组（加入PBS，红花多糖浓度为0mg/ ml）、第2、3、4组为含有不同浓度的红花多糖（浓度分别为0.16 mg/ml、0.32 mg/ml、0.64mg/ml）的实验组[1]。

2.2 MTT比色法检测细胞增殖抑制率 消化细胞，以3000个/孔细胞的密度接种于96孔板，每个孔分别加入200μl培养基，每种处理设8个重复。分别加入不同浓度的红花多糖进行培养，48 h后吸弃培养液，每孔分别加入180μl培养基，并分别加入20μl MTT溶液（5 mg/μl），培养箱中继续培育4 h后吸弃孔内培养基，每孔加入100 ml DMSO，用酶标仪测定吸光度（A）值，并计算增殖活性抑制率。

2.3 Transwell实验检测对细胞侵袭能力的改变 消化细胞，取一个24孔板，每孔加入500?l培养基（含20%血清），将小室放入24孔板;上层每孔加入200?l培养基（含5%血清及）及25000个细胞，混匀后在培养箱中培养;过夜后用棉棒擦掉小室上层细胞，加入500?l甲醇固定10-15min，PBS清洗，结晶紫染色，PBS清洗，显微镜下照相。

2.4 划痕迁移实验检测对肿瘤细胞迁移能力的影响 消化细胞，以每孔1.25×105个细胞的密度种于24孔板，过夜后用10?l枪头与24孔板底垂直做十字划痕;用PBS清洗洗去划下的细胞，分别加入不同红花多糖浓度的完全培养基，放入培养箱中培育，分别于0、24、48h拍照。

2.5 Real-time PCR检测MMP-9基因的mRNA表达 红花多糖处理SH-SY5Y细胞24h后，收集细胞，每（5～10）×106个细胞中加入1mL Trizol，反复吹充分裂解细胞。加入200μL氯仿，充分震荡混匀后室温放置2～3min。4℃12000g离心15min，吸取上层水相至新EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置5～10min。4℃12000g，离心10min，离心后管壁和管底出现胶状沉淀。加入1mL 75 %的乙醇，悬浮沉淀。4℃12000g离心5min，室温晾干5min后加入20μL无Rnase的水，充分震荡混匀。用分光光度计检测总RNA的OD值并计算其浓度。然后进行逆转录，用于real-timePCR检测，用StepOneSoftware分析软件分析并输出Ct值及熔解扩增曲线。

2.6 Western blot检测MMP-9蛋白的表達 红花多糖处理SH-SY5Y细胞48h后，收集细胞，加入蛋白裂解液提取总蛋白，使用蛋白检测试剂盒对所提取的蛋白进行浓度测定，测定后每管各加入1/4倍体积的5×SDS上样缓冲液，把样品放置于95℃的金属浴锅中变性10 min，变性后的蛋白用于上样进行SDS-PAGE电泳并转膜，转膜结束后加封闭液封闭12 h，封闭过的膜加入MMP-9抗体4℃过夜。次日，TBST摇床洗膜，然后加入二抗（1：1000）室温孵育1 h，TBST洗膜，增强化学发光剂（ECL）显色，发光仪发光，记录并保存结果;使用Photoshop、ImageJ处理分析数据。

2.7 统计学分析方法 实验所得数据用均数士标准差（X士S）表示，通过SPSS 17. 0统计软件的t检验和方差分析进行统计处理，取P<0. 05说明有差异，代表有统计学意义，用Graphpad Prism 5.0软件进行绘图。

3 结果

3.1 细胞生物学功能实验：加入不同浓度的红花多糖可使SH-SY5Y细胞的增殖能力显著降低 （P<0.05） （图3-1）、侵袭能力显著降低（P< 0.05）（图3-2）、迁移能力显著下降 （图3-3），且随着红花多糖的浓度增加，对SH-SY5Y细胞增殖、侵袭及迁移的抑制作用越明显。

3.2 加入不同浓度的红花多糖可使人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中MMP-9的转录本（mRNA）和蛋白表达水平显著下调（P< 0.05，图3-4和图3-5）。

4 讨论

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康并危及生命，转移是肿瘤患者死亡的首要原因。NB是最常见的起源于神经脊的外周神经系统实体瘤，占儿童肿瘤死亡病例总数15 %左右。在影响肿瘤转移的诸多因素中，MMPs与肿瘤转移关系非常密切。MMPs活性的增加与乳腺、肺、结肠等多种恶性肿瘤的侵袭和转移相关[2]，它能导致细胞外基质降解，使得肿瘤细胞能够突破细胞外基质组成的屏障，从而导致肿瘤细胞发生浸润和转移[3]。MMP-9是MMPs中很重要的一员，在多种类型肿瘤中MMP-9表达水平上调，且MMP-9高表达患者预后较差，生存时间相对较短。程瑜等的研究已经证实在NB组织中 MMP-9的表达是上调的，但是MMP-9在 NB组织中的表达调控机制仍不明确[4]。下调MMP-9，是抑制肿瘤转移，延长肿瘤患者生存时间的突破口。

从中药中寻找下调MMP-9，对抗肿瘤侵袭和转移的药物，对推进我国中医药现代化具有非常重要的意义。红花多糖提取自中药红花，大量研究表明红花多糖具有抗肿瘤、抑制血小板聚集、调节机体免疫等多种作用[5]，红花多糖抗肿瘤的机理是抑制新生血管生成，以及抑制肿瘤细胞增殖。本研究重点探讨红花多糖对神经母细胞瘤SH- SY5Y细胞增殖、侵袭、转移的作用。

我们的研究发现在神经母细胞瘤中，红花多糖通过转录抑制下调 MMP-9的表达，且红花多糖可以通过下调MMP-9抑制神经母细胞瘤侵袭和转移;而且红花多糖可使神经母细胞瘤的增殖能力降低，但是不知道确切机制，需要进一步研究阐明。这项研究拓展了我们关于红花多糖在转录水平调节MMP-9的认识，且表明红花多糖可以作为NB新治疗靶标的潜在价值。

随着对中药的研究不断深入，某些中药的研究已表现出较好的开发前景。但目前很多研究还局限于实验性研究，相信随着研究的不断深入，中药抑制MMPs抑制肿瘤侵襲和转移的机理会有更大的突破，并进一步实现临床应用。

参考文献：

马新博，周振座，宫汝飞.红花多糖对人胃癌 SGC-7901 细胞抑制作用的初步研究[J].Guangxi Medical Journal ，2012 ，34 （11 ）：1444-1446.

王珍珍，陈良良.中药抑制基质金属蛋白酶抗肿瘤转移的研究进展[J].黑龙江中医药，2015，（2）：72-73.

邓路婵，周黎明.基质金属蛋白与恶性肿瘤转移的关系[J].四川生理科学杂志，2014，36（2）：80-82.

程瑜，孙立荣.基质金属蛋白酶及其抑制因子与神经母细胞瘤侵袭转移的关系[J].临床研究，2005，27（3）：164-166.

孙伟，童仕伦，郑勇斌.红花多糖对人结肠癌 LoVo 细胞增殖、凋亡、侵袭作用机制研究[J].药学研究，2016，20（ 6）：1049-1050.