DNA甲基转移酶1在卵巢癌中的表达意义及其作用机制

周 娟 刘月合 王春佟

DNA 甲基化异常是重要的肿瘤表观遗传学特征[1-2]。DNA甲基化的建立和维持由 DNA 甲基转移酶(DNMTs) 催化发生并完成。哺乳动物体内 DNMT 分为 3 个家族，分别是DNMT1、DNMT2 和 DNMT3 家族，其中 DNMT1 在细胞内主要起维持甲基化的作用，DNMT3 主要起从头甲基化的作用[3-4]。本实验采用免疫组化技术，检测 DNMT1 在卵巢癌组织及正常卵巢组织中的表达，并探讨其与临床分期及病理分级之间的关系；此外，在细胞水平检测DNA甲基转移酶1在卵巢癌中的表达及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集我院住院手术切除的 31 例卵巢癌患者新鲜手术标本，年龄30～70岁，中位数为 55岁。所有病例均接受卵巢癌肿瘤细胞减灭术并经术后病理证实为卵巢上皮性癌，术前均未予以放射和化学治疗[5-6]。另收集正常卵巢组织15例(因子宫肌瘤及子宫腺肌症行全子宫+双附件手术)，所有病例均经术后病理证实为正常卵巢组织，标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片后免疫组化染色。

1.1.2 细胞 人卵巢癌细胞 SKOV3 由中国科学院上海细胞库提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SKOV3细胞复苏后，使用含10%胎牛血清的改良型 RPMI 1640 培养基，于 37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 将SKOV3细胞悬液种于6孔板中，待细胞贴壁且融合度为70%～90%。配制转染试剂混合液(每孔)：转染试剂 6 μl + 质粒 2 μg(siRNA 15 μl)+无血清无双抗 RPMI 1640 200 μl。冰上静置20 min。逐孔弃去细胞原培养液，加入含10%血清的RPMI 1640培养基1.3 ml及转染试剂混合液 200 μl。轻晃混匀后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。72 h提取总蛋白备用。

1.2.3 主要试剂及仪器 RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国 GIBCO 公司，DNMT1 过表达质粒购自美国 ADDgene公司，DNMT1 siRNA 购自广州锐博公司，X-treme GENEsiRNA 转染试剂购自瑞士罗氏公司，CCK8检测试剂盒由日本同仁化学研究所提供，DNMT1及β-actin抗体购自美国Cell signaling公司，HRP标记的免疫组化二抗试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，Transwell小室购自美国 Mil-lipore 公司[7-8]。

1.2.4 Western blot 检测 抽提细胞总蛋白，各取40 μg蛋白，SDS-PAGE分离后转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入DNMT1单克隆抗体(1∶1 000) 或β-actin单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜 8 min×5 次，加入相应的二抗(1∶2 000)，室温孵育 2 h，TBST 洗膜8 min×5次。加入发光试剂ECL曝光。

1.2.5 Transwell 小室实验 先消化细胞，用无血清无双抗RPMI 1640 培养基反复洗涤细胞 3 次，重悬细胞后计数，再用无血清无双抗RPMI 1640培养基重悬，使细胞密度达 2 ×106/ml 以上。将Transwell小室放入24孔板内，每个Transwell小室上室中悬空加入100 μl细胞悬液含细胞 1×105个。在Transwell小室的下室中加入500 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基。37 ℃、5%CO2培养箱中孵育20 h或者24 h。用镊子取出小室，移至另一含有500 μl 1×PBS的孔内浸泡2～3 min，取出小室，用棉签逐个小心擦去微孔膜上层细胞，如此用 PBS 洗 3 次。

1.3 统计学方法

所有数据采用(均数±标准差)表示，运用统计学软件SPSS 22.0(Chicago，IL，USA) 进行统计分析。2组之间差异比较采用独立样本双侧t检验，2组之间构成比比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组织及正常卵巢组织中DNMT1的表达

免疫组化检测31例卵巢癌组织及15例正常卵巢组织中DNMT1的表达，结果提示卵巢癌组织中 DNMT1阳性率为83.9%(26/31)，显著高于正常卵巢组织的20.0%(3/15)，差异有统计学意义(χ2=17.701，P<0.001)。

2.2 DNMT1表达与卵巢癌临床病理特征的关系

DNMT1 表达与肿瘤的临床分期、病理分级及远处转移有关(表1)。

表1 DNMT1 表达与卵巢癌临床病理特征的关系(例，%)

2.3 敲低 DNMT1 对卵巢癌细胞增殖及迁移能力的影响

在SKOV3细胞中，转染DNMT1 siRNA 敲低 DNMT1后，实验结果表明 DNMT1 蛋白水平明显下降，CCK8 实验结果证实敲低DNMT1后SKOV3的增殖能力下降，Transwell小室实验结果提示敲低DNMT1后SKOV3迁移能力下降。

3 讨论

DNMT 是一组含有高度保守-COOH 末端，结构相似的一类蛋白质，其中DNMT1 主要负责维持基因组甲基化状态，对抑制人癌细胞中抑癌基因的表达有重要作用，其活性升高被认为是肿瘤细胞早期分子改变的一个特征[9-10]。同时，DNMT1 在基因启动子的超甲基化中发挥关键作用，并与人类的恶性肿瘤癌变有关。随着对表观遗传学及肿瘤发病机制研究的进一步深入，人们逐渐认识到表观遗传调控在肿瘤发生发展中发挥重要作用[11-12]。DNA 甲基化是表观遗传的一种，在肿瘤的进程中扮演重要角色，肿瘤细胞中常发现 DNA 整体的低甲基化以及特定区域的高甲基化，尤其是CpG岛的高甲基化在肿瘤中意义重大。

有学者发现在膀胱癌组织中，DNMT1 水平显著升高，与肿瘤抑制基因 DBCC R 1 的 CpG岛启动子超甲基化有关。肿瘤抑制基因启动子区，通过甲基化作用抑制其表达[13]。有学者发现运用 DNMT 抑制剂可逆转抑癌基因高甲基化并激活抑癌基因表达，进而抑制肿瘤。有报道发现DNMT抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷可激活抑癌基因 HmLh1 并导致子宫内膜癌细胞凋亡[14]。DNA 的甲基化与肿瘤的发生发展密切相关。抑癌基因和修复基因的甲基化会引起抑癌基因的沉默和修复基因的失活，使得对肿瘤抑制的丧失和增加了基因的损伤。而原癌基因的低甲基化状态会使异常细胞趋向无限制生长，形成肿瘤，甚至在肿瘤进展过程中促进远处转移[15]。

本研究结果显示，DNMT1 在卵巢癌组织中的阳性率显著高于正常卵巢组织，且其表达与临床分期、病理分级及远处转移相关，临床分期越晚、病理分级越高、有远处转移者DNMT1的阳性率越高。在真核生物中，DNMT1 是维持 DNA 甲基化的关键酶，其表达与基因印记、细胞分化和发育、肿瘤形成等密切相关。已有研究证实，DNMT1 促进肿瘤的发生和发展，这与我们的研究结果一致[16]。我们课题组之前的研究也发现，DNMT3A 促进卵巢癌细胞上皮间质转化(EMT)发生，进而促进卵巢侵袭和转移，这提示我们甲基化在卵巢癌的发生发展中有重要的作用。

综上所述，DNMT1 在卵巢癌组织中的阳性率明显高于正常卵巢组织，具有促进卵巢癌细胞增殖和迁移的作用，但是具体的作用机制仍需后续研究进一步阐明。本研究为卵巢癌的靶向治疗提供了新的研究思路。