雷帕霉素促进缺血性脑卒中后神经血管单位修复*

吴致远， 邓仪昊， 张永杰， 何红云

（昆明理工大学医学院，云南昆明650500）

脑卒中（cerebral stroke）是一种由脑血管病变引起的、以脑组织损伤及相应神经功能缺陷为主要临床表现的急性脑血管病，可分为缺血性和出血性2种，该病具有致残率高、死亡率高和发病率高的特点［1］。我国每年脑卒中新发病例超过200万，约有120万人死于脑卒中相关疾病，脑卒中已经成为了家庭和社会的沉重负担［2］。由于仅有的溶栓药物组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）治疗有着严格的时间及其他禁忌症的限制，加之缺血/再灌注时会再次造成脑损伤，所以寻找新的治疗方法迫在眉睫［3］。脑卒中后缺血区神经元功能丧失是导致神经功能障碍的主要原因，因此挽救缺血区的神经元是卒中后恢复脑功能的重要措施。

神经元在体内并非孤立存在，其与周围的血管、细胞等共同组成神经血管单位（neurovascular unit，NVU）［4］。NVU由神经元、内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞/小胶质细胞、平滑肌细胞、细胞外基质等组成，能够维持血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的结构与功能，介导神经-血管的耦合，调节血管张力［5］，控制血-脑间的物质交换，对维持循环系统及大脑内环境的稳定起着至关重要的作用［4］。大量研究表明，雷帕霉素（rapamycin）具有神经保护作用，因此本文就雷帕霉素对缺血性脑卒中后NVU的作用及机制进行综述。

1 缺血性脑卒中导致的NVU损伤

NVU在脑卒中的发病过程中具有重要意义［6］。缺血性脑卒中发生后，血流停止便开始发生一系列级联反应，并随着时间和空间的推移而发生变化，导致神经细胞的损伤及水肿的形成［7］。在缺血性脑卒中的超急性期，细胞出现线粒体功能受损、pH值下降、ATP合成受损、离子泵活性降低等现象，最终酸性的环境、Ca2+和Na+的积累及水分的流入导致了细胞的肿胀和死亡［8］。这些损伤发生的同时，一些内源性的保护机制，比如神经元的自噬同时被激活［9］。而从NVU的水平来看，损伤主要发生在以下几方面：一是BBB被破坏，缺血后内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞间的紧密连接消失，细胞质基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）释放增加［10］；二是炎症反应，通过实验检测到梗死发生后脑组织中辅助性T细胞与调节性T细胞失衡，免疫炎症反应被激活［11］，周细胞还能分泌许多损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）和诸如白细胞介素一类的炎症因子以启动机体的非感染性免疫及炎症过程［12］；三是毛细血管阻塞，在中风的超急性期后，周细胞的收缩导致毛细血管阻塞（产生无回流现象），并进一步增加BBB的通透性，促进脑水肿的形成［13］。

2 缺血性脑卒中后雷帕霉素对NVU的调节作用

雷帕霉素的化学结构为疏水性的大环内酯，临床上用于肾移植患者的免疫抑制及罕见病淋巴管平滑肌肌瘤病的治疗［14］。雷帕霉素在体内与FKBP-12蛋白相结合产生复合物，该复合物能够与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相结合，并抑制mTOR的活化［15］。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，拥有mTORC1和mTORC2两种复合物，但只有mTORC1对雷帕霉素敏感，其在调节细胞的生长和增殖、调控核糖体RNA的转录及核糖体的生物发生、抑制自噬、调节脂质合成等诸多方面发挥作用［16］。而mTORC2通过调控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）、血清和糖皮质激素调节激酶1（serum and glucocorticoid-regulated kinase 1，SGK1）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等蛋白质的磷酸化，控制细胞生存，调控细胞骨架［17］。总之，mTOR在细胞的生长及代谢中扮演着极为重要的角色，它的失调与大量的疾病有关［18］。

2.1 雷帕霉素提高NVU中神经元的自噬水平 神经元是NVU的重要组分。脑卒中发生后，缺血区损伤神经元面临坏死、凋亡和自噬3种命运。位于缺血中心区神经元在脑中风后数分钟内即发生坏死，但在缺血周围区即缺血半影区，NVU内的星形胶质细胞能与神经元建立联系并向其输送线粒体进行能量代偿，大大缓解其的生存压力［19］。此时，诱导这些细胞选择自噬途径将有助于神经元的保护。使用雷帕霉素进行缺血前处理可以诱导脑缺血/再灌注过程中的自噬，并在存活率、大脑梗死面积、神经行为学评分等方面表现出优势［20］。在永久性缺血的模型中，缺血预处理可以减少梗死面积，当使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）处理时，雷帕霉素的保护效果消失［21］。由此可见，雷帕霉素能够通过激活神经元自噬缓解缺血所带来的损伤，从而起到神经保护作用。利用神经元靶向的转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）过表达治疗自噬-溶酶体障碍能够减轻缺血性脑卒中所产生的损伤［22］。相反，有研究认为在神经元缺血的情况下自噬具有损伤作用，抑制自噬也能够起到神经保护的作用［23］。这意味着缺血性脑卒中后自噬对神经元的调节具有双重作用。那么，雷帕霉素诱导的自噬是否会减轻缺血性损伤？使用雷帕霉素和氯喹进行处理后发现二者都能减小大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的梗死面积，改善神经行为学评分，但仅有雷帕霉素治疗组的大鼠存活率得到提升，这说明在卒中后药物诱导自噬比抑制自噬更有利于其治疗［24］。另有荟萃分析指出：低剂量的雷帕霉素治疗能够更有效减小梗死体积，这可能是通过诱导最佳的自噬水平而起到神经保护作用［25］（图1A）。

2.2 雷帕霉素提升NVU的血流量 NVU中血流量的提升可以极大减轻脑卒中后的功能障碍。雷帕霉素能够显著改善NVU中的血流情况。在阿尔茨海默病模型中，雷帕霉素抑制mTORC1后可以提升脑血流量，恢复脑血管密度，维持BBB的完整性并改善行为表现［26］，其机制被证实为雷帕霉素抑制mTOR后导致内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性升高，从而扩张血管［27］（图1B）。另一项研究评估了在体内利用雷帕霉素治疗中风后的脑血流量，显示再灌注2 h的脑血流量没有显著改善，梗死面积增加［23］，可能是因为长期（3 d）且大剂量（20 mg/kg）注射雷帕霉素抑制了对细胞应激反馈和生存所至关重要的mTORC2［28］。平滑肌细胞在调节脑血管张力、血管完整性和脑稳态方面起着至关重要的作用［29］。而再灌注后机体自我调控能力减弱与mTOR通路可能有关。在啮齿动物MCAO模型中，栓塞30 min后开始出现自主调控的衰弱，并一直持续到24 h，表明MCAO大鼠大脑中动脉的自我调控能力衰减程度与围绕着动脉的平滑肌细胞细胞骨架重排列程度呈正相关［30］。另有实验证实，雷帕霉素亦能通过抑制人横纹肌肉瘤细胞系中RhoA的表达，减少细胞骨架的重组及细胞运动，因此雷帕霉素可能是通过限制大脑动脉中平滑肌肌动蛋白细胞骨架的重排来缓解动脉自我调控能力的衰减，从而减少对NVU的毒害作用［31］（图1C）。

2.3 雷帕霉素减少NVU的无回流现象 对大鼠MCAO术后的预后状况评估发现，再灌注时的血流量比缺血时的血流量更加重要［32］。而缺血发生后，毛细血管随着周细胞一同收缩，中性粒细胞、血小板、红细胞等堆叠将导致无回流或低回流现象［33］，因此减少NVU中无回流现象的发生对缺血性脑卒中后神经功能的恢复具有重要意义。无回流现象的发生是由于缺血发生后大量Ca2+进入到周细胞胞质，激活了Ca2+/肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）激酶途径，诱导周细胞的快速收缩［34］。雷帕霉素通过对mTOR的抑制，可以降低MLC对钙的敏感性，缓解缺血时大量Ca2+内流诱导的周细胞收缩所致的毛细血管堵塞，从而发挥神经保护作用［31］（图1D）。

2.4 雷帕霉素促进NVU对BBB结构与功能的维持 NVU对BBB的结构与功能的维持具有重要意义。脑卒中发生后，周细胞与血管相分离，此时周细胞和内皮细胞的胞间连接消失［12］，周细胞还将释放MMPs，这将再次诱导紧密连接蛋白复合物的解聚与重组，进一步增加BBB的通透性［35］。同时星形胶质细胞出现细胞毒性，表现为细胞胀大，水孔蛋白（aquaporin，AQP）及胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的 表 达增加［36］，伴MMPs的释放增加［37］。这些病理变化都使得BBB的完整性受到破坏，血管通透性增加，导致脑水肿的发生。雷帕霉素和不依赖mTOR途径的自噬诱导剂碳酸锂在氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型和MCAO模型中均表现出有利于保持BBB完整性的作用［38］。在一个糖尿病及MCAO的复合模型中，雷帕霉素能够在栓塞1 h和再灌注2 h内降低非糖尿病大鼠BBB的通透性［39］。体外的细胞培养实验证明，BBB的损伤是由PKC-β调控的RhoA/Rho激酶/MLC2通路所造成的［40］。抑制Rho激酶能够调节内皮细胞的应激反应，增加细胞间紧密连接，从而改善MCAO大鼠BBB的完整性［41］。mTOR位点对Rho激酶通路至关重要，因此雷帕霉素既可通过提高内皮细胞的活力，亦可通过直接稳定细胞骨架及保持细胞间的紧密连接来改善BBB的完整性。BBB破裂时，周细胞通过缺血激活的p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径释放MMP-9，从而破坏 BBB［42］。雷帕霉素可以通过上调MAPK磷酸酶1（MAPK phospatase-1，MKP-1）的表达来抑制p38 MAPK的活性［43］，从而抑制MMP-9和AQP4的表达，减少梗死体积，并维持BBB的完整性［44］（图1D）。尽管雷帕霉素对于星形胶质细胞和周细胞MMP的释放作用机制仍有待完善，但雷帕霉素在维持缺血性脑卒中患者BBB稳定性上依旧表现出了巨大的潜力。

2.5 雷帕霉素调控NVU的炎症细胞以促进神经保护 卒中发生后，NVU中的内皮细胞因为细胞因子细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、P-/E-选择素和 MMPs的表达上调，促使其向炎症表型转化［45］。同时小胶质细胞源性巨噬细胞（microglia-derived macrophages，MiDM）和单核细胞源性巨噬细胞（monocytederived macrophages，MoDM）将会浸润脑组织，它们分为促炎的M1型和抗炎的M2型。在脑缺血发生后的不同时期，巨噬细胞将会向2个不同的方向极化，卒中发生后的5 d内M2表型占据优势，此后则是M1表型为主导［46］。高浓度的炎症因子会导致动脉粥样硬化斑块的破裂和闭塞性血栓的形成，进一步加剧脑的损伤，脑卒中后有效的炎症过程对预后非常重要［47］。体内MCAO模型显示，雷帕霉素通过抑制mTOR促进巨噬细胞从M1型向M2型的转变，并上调Arg-1和YM-1基因的表达，从而抑制炎症反应［48］（图1E）。缺血时调节性T细胞与巨噬细胞/小胶质细胞的相互作用能够调节炎症的进程，而雷帕霉素能够增强调节性T细胞的抗炎活性，从而降低小胶质细胞的促炎能力［49］。鉴于血流能将外周器官中的多种物质输送到大脑，因此我们还需要关注雷帕霉素作用于外周时的作用：脑卒中后大量的中性粒细胞会迁移到病灶，血小板和中性粒细胞在脑部毛细血管的聚集将会导致血管再通后的低灌注现象，而雷帕霉素具有抗中性粒细胞和抗血小板的活性，有利于卒中的预后［50］。

Figure 1.Neuroprotective effect of rapamycin（Rapa）on neurovascular unit（NVU）in ischemic stroke.mTOR：mammalian target of rapamycin；BBB：blood-brain barrier；MLC：myosin light chain；MAPK：mitogen-activated protein kinase；MMP-9：matrix metalloproteinase-9；AOP4：aquaporin 4.图1 雷帕霉素在缺血性脑卒中对神经血管单位的神经保护作用

3 小结

NVU在大脑的正常生理活动中发挥着重要的作用，缺血性脑卒中将导致NVU中多种组分发生功能障碍及病理改变。实验室中已经证实了雷帕霉素能够通过多种方式对缺血后的NVU进行调控从而达到神经保护的效果。但由于mTOR作为哺乳动物体内的一个高保守位点，其涉及调控多条信号通路，关乎细胞的营养、代谢、生长、发育等诸多方面［51］，因此我们在考虑使用雷帕霉素作为神经保护剂治疗脑卒中时，还必须进一步摸清其具体作用机制、给药时间窗口、最佳剂量以及可能的副作用等。综上所述，尽管雷帕霉素作为一款成熟免疫抑制药物已经应用于临床，但其在神经保护方面的用途仍有广阔的探索和应用前景。