丹参通脉胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤神经保护作用及机制研究

1.山东省沂源县中医医院，山东 沂源 256100；2.山东省胶州市人民医院，山东 胶州 266300；3.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；4.山东省德州市中医院，山东 德州 253013

缺血性脑血管病是由于多种因素导致的大脑血液循环障碍、脑组织受损而引发的局灶性神经功能障碍，其发病率约占80%[1]。及时恢复大脑血液供应可减轻神经功能缺损症状。而CIRI是指一定时间内在恢复血液供应后，大脑功能不仅没有得到改善，反而出现更加严重的神经功能障碍及组织损伤[2]。氧化应激及炎症反应作为CIRI极其重要的病理机制受到了广泛关注，大量研究结果证明氧化应激、炎症反应与CIRI具有密切联系[3]，从而为CIRI的防治提供了具体的思路及方法，越来越多的研究发现许多中药单体活性成分对CIRI具有良好的改善作用，然而目前尚缺乏对于CIRI中药复方制剂的研究。

丹参通脉胶囊由丹参、三七、水蛭、三酮(葛根黄酮、 银杏叶黄酮、山楂叶黄酮)、牡丹皮、芍药等药物组成，具有行气活血、祛瘀通络之功效。现代药理研究发现，丹参通脉胶囊中的多种成分均具有抗氧化、抑制炎症反应及神经保护等作用，并且多次在大鼠MCAO模型中取得了较好的疗效。丹参的甲醇提取物具有较强的抗氧化活性，水溶性成分如丹酚酸B也能升高大鼠血清总SOD并且降低MDA的水平，丹参酮通过抑制TNF-α等多种炎性因子的mRNA和蛋白表达从而发挥抗炎活性[4]。朱会超等[5]发现三七总皂苷能明显抑制巨噬细胞和小胶质细胞TNF-α和IL-6的表达，减轻再灌注脑损伤。该复方制剂中的其他成分在不同研究中均被证实具有不同程度的抗氧化、抗炎、抑制神经元凋亡等作用。

本研究旨在揭示丹参通脉胶囊治疗缺血性脑血管病的机理，探讨丹参通脉胶囊对CIRI的神经保护作用，并尝试从氧化应激及炎症反应角度阐明其作用机制，为其进一步在临床中的使用奠定理论基础。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠80只，质量320～350 g，雌雄各半，由山东省动物中心提供，许可证号：SDCK20090001。自然光线下给予充足饮水和饮食，自由进食水。

1.2 药物 丹参通脉胶囊(山东省中医药研究所)；血塞通片(批号：200206193742，规格:50 mg/片，云南特安呐股份有限公司)。制备：实验前将丹参通脉胶囊制成52 mg/mL浓度的悬浊液，将血塞通片制成28 mg/mL等浓度悬浊液，4 ℃保存，备用。

1.3 试剂 2,3,5-氯化三苯基四氮唑、超氧化歧化酶(SOD)ELISA检测试剂盒、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 仪器 酶标仪(美国BD公司)；DDL-5低速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。

2 方法

2.1 造模[6]术前1周，大鼠自由饮水及进食。称重后将大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，仰卧固定，颈去毛消毒，于颈部正中开始切开并逐层分离，先分离右侧颈总动脉，再分离颈内动脉、颈外动脉，结扎右侧颈总动脉近心端及其所有分支动脉，分离右侧颈外动脉，并沿着颈外动脉结扎翼颚动脉，在颈外动脉近端备线，用动脉夹夹闭其远端，在颈总动脉分叉处做一切口，插入尼龙线，推进时感阻力，表明栓线头部到达大脑中动脉起始部，阻断同侧大脑中动脉所有血供来源，外留约长的1 cm线头，缝合手术切口，完成一侧造模。缺血2 h后，轻拉线头至有阻力，提示尼龙线头部到达颈总动脉切口处，从而建立缺血再灌注模型。待大鼠苏醒后评估神经功能缺损，若出现神经功能缺损的症状则视为模型制作成功。假手术组大鼠除不插线外，其余步骤同上。

2.2 分组及给药 将造模后的SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、血塞通组、丹参通脉胶囊组各20只。大鼠大脑中动脉再灌注手术缺血2 h后，给丹参通脉胶囊组大鼠进行52 mg/mL浓度的悬浊液灌胃(1 mL/100 g)。血塞通组大鼠进行28 mg/mL等浓度悬浊液灌胃(1 mL/100 g)。假手术组及模型组予等量生理盐水灌胃。各组大鼠每日灌胃1次，共给药14 d。

2.3 神经功能评分 依据Longa等[7]5分制法对各组大鼠进行神经行为学评分。评分方法如下：无神经行为损伤症状计为0分；未能完全伸展对侧前爪计为1分；向对侧转圈计为2分；向对侧倾倒计为3分；不能自发行走，意识丧失计为4分。

2.4 大鼠脑梗死体积比测定 大鼠脑缺血再灌注24h后处死，开颅取脑，将视交叉向后的脑组织置于冰浴中切成一系列厚度3 mm的切片，置于TTC缓冲液中37 ℃避光染色30 min。用Image-ProPlus 6.0软件处理图片，计算各组脑梗死体积比。计算公式：脑梗死体积比=[(非缺血侧半球面积-缺血侧半球未梗死区面积)×厚度(3mm)/全脑体积]×100%。

2.5 脑组织中SOD、MDA的测定 脑组织中SOD、MDA采用酶联免疫法进行测定。大鼠处死后取大鼠缺血一侧大脑额顶叶皮层组织，用生理盐水制成10%匀浆后严格按照SOD、MDA检测试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定各孔的吸光度。

2.6 血清中炎症因子的测定 大鼠脑缺血再灌注24h后处死，腹主动脉采血，分离血清，设置离心机条件为4 ℃、3500 r/min，离心15 min后，取上清液置-20 ℃冰箱保存备用，按TNF-α、IL-1β、IL-6试剂盒说明进行操作。酶标仪测量各孔的吸光度。

2.7 统计学分析 所有实验数据采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料均以均数加减标准差表示，组间比较采用t检验或校正t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 丹参通脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响 与假手术组比较，模型组大鼠的神经功能评分明显增高(P<0.01)；与模型组比较，丹参通脉胶囊组能使大鼠的神经功能评分显著降低(P<0.01)；与血塞通组比较，丹参通脉胶囊组对大鼠脑缺血再灌注引起的行为障碍改善效果更优(P<0.01)。见表1。

3.2 丹参通脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积比的影响 与假手术组比较，模型组大鼠的脑梗死体积比明显增高(P<0.01)；与模型组比较，丹参通脉胶囊组能使大鼠的脑梗死体积比显著降低(P<0.01)；与血塞通组比较，丹参通脉胶囊组对大鼠脑梗死体积比降低效果更优(P<0.05)。见表2。

表1 丹参通脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响

表2 丹参通脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积比的影响

3.3 丹参通脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织中SOD、MDA的影响 与假手术组相比，模型组SOD活性显著降低，MDA水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，丹参通脉胶囊组SOD活性升高，MDA水平降低(P<0.01)；与血塞通组相比，丹参通脉胶囊组减轻大鼠脑缺血再灌注后的氧化应激反应作用更明显(P<0.01)。见表3。

表3 丹参通脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织中SOD、MDA的影响

3.4 丹参通脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠血清中炎症因子的影响 与假手术组相比，模型组的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，丹参通脉胶囊组TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著降低(P<0.01)；与血塞通组比较，丹参通脉胶囊组对炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的抑制作用更明显。见表4。

表4 丹参通脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠血清中炎症因子的影响

4 讨论

缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的一种高发病率、高致残率及高死亡率的重大疾病，治疗该病的主要目标是尽早恢复脑组织供血从而减轻脑组织损伤及改善神经功能，然而再灌注后对大脑产生的二次损伤成为目前研究的难点及热点。脑缺血再灌注损伤机制十分复杂，可引起一系列细胞结构、蛋白质分子及其调节过程的变化，主要包括氧化应激、炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、血脑屏障破坏等病理过程[8-9]。

大鼠因具有与人类相似的脑血管解剖结构、功能等特点，因此常被用于复制脑缺血的实验动物模型[10]。线栓法制备的MCAO模型是目前所公认的缺血性脑卒中的理想模型，该模型为缺血性脑损伤的实验研究提供了条件[11]。用于MCAO模型的评价方法多种多样，如神经功能评分、TTC染色、脑组织含水量、局部脑血流测定等。脑梗死体积测定能够直观地了解大鼠脑缺血情况，且实验步骤简单易行，是MCAO模型较常用的评价方法。而神经功能评分法无需借助特殊仪器设备，具有直观、简便的优点，可以从整体角度观察动物神经损伤程度[12]，因此本研究采用神经功能评分与脑梗死体积比评价相结合的方式观察丹参通脉胶囊对大鼠的神经保护作用。研究成功构建了脑缺血再灌注模型大鼠，在此基础上应用丹参通脉胶囊进行干预，结果显示丹参通脉胶囊可以提高脑缺血再灌注大鼠神经功能评分，减少大鼠脑组织的坏死，提示其可以保护脑缺血再灌注大鼠的神经功能，减少损伤区域。

由于脑组织代谢旺盛、需氧量高，导致较多的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)生成。正常生理情况下，ROS的生成与清除处于动态平衡，在脑缺血再灌注损伤的病理过程中，过量的ROS引起脂质过氧化和细胞内钙超载负荷等一系列反应从而直接导致细胞坏死，也可以通过激活多种途径(如线粒体途径、内质网途径、膜受体途径或DNA修复酶途径等)引起神经元凋亡等过程[13-14]。SOD是体内最重要且最有效的抗氧化酶之一，可清除过量的氧自由基，维持机体代谢平衡，SOD活性间接反映了体内抗脂质过氧化反应及清除氧自由基的能力。ROS作用于生物膜上不饱和脂肪酸形成过氧化脂质，该产物进一步降解形成毒性产物-醛类，造成膜结构和功能的破坏，MDA即脂质过氧化反应的终产物之一，其水平的高低可反映脑组织中脂质过氧化反应的程度，间接反映了细胞的损伤情况[15]。本研究结果显示脑缺血再灌注大鼠模型中SOD活性下降而MDA水平升高，提示再灌注后大量氧自由基的生成消耗了SOD的储备，脂质过氧化加剧从而导致MDA升高，丹参通脉胶囊明显增强了脑组织中SOD的活性并且降低了MDA的含量，证明其对减轻再灌注后的氧化应激具有一定的作用。

脑缺血再灌注后大量浸润的炎性细胞因子引起级联放大的炎症反应是造成脑损伤的重要原因之一。研究发现，炎性细胞因子可作用于血管内皮细胞，促使趋化因子、粘附分子和E/P-选择素的表达增加，破坏血脑屏障的结构和功能并促进脑组织水肿的形成。此外，炎性细胞因子还能通过增强花生四烯酸的代谢来增加自由基的释放进而加重氧化应激损伤[16]。TNF-α 是由巨噬细胞、单核细胞分泌的一种促炎因子，在脑缺血发生时炎性相关细胞过度表达使其分泌增加，TNF-α可进一步激活星形胶质细胞和小胶质细胞，分泌大量 IL-1β等炎症因子，引起一系列的炎症级联反应，从而加重脑组织损伤[17-18]。IL-1β是一种炎症细胞的强烈趋化因子, 能诱导和促进脑缺血后炎症介质的损伤作用[9]。IL-6在大脑中主要由小胶质细胞和星形胶质细胞产生，是关键的炎性细胞因子之一，参与炎症调节和免疫反应，能够诱导其他炎症介质的产生并且协同其他炎性细胞因子促进B/T细胞活化，加重脑组织损伤[19]。故脑缺血再灌注损伤越严重，体内炎症反应越剧烈，这三种炎症因子也会出现相应的升高。本次研究发现TNF-α、IL-1β、IL-6在脑缺血再灌注大鼠模型的血清中均有升高，给予丹参通脉胶囊后上述三种炎症因子均有不同程度的降低，提示丹参通脉胶囊可有效减轻脑缺血再灌注损伤后的炎症反应。

缺血性脑血管病大体属于中医学“中风”病范畴，中医学认为阴阳失调，气血逆乱是其基本病机，病理性质应属本虚标实，本虚多为阴精、气血亏虚，标实多为痰瘀内阻于脑。然而根据现代医学对于其病因的认识可以推断痰瘀阻络在“中风”病的发生发展中起着极其重要的作用，脑缺血再灌注损伤则类似于中医学中气血津液运行不畅，痰瘀渐而变生浊毒损伤脑窍的病理过程，治宜行气活血、祛瘀通络。丹参通脉胶囊以中医理论基础为指导，活血而不耗气，通络而不伤正，兼顾凉血清热，组方精准，功效显著。

综上所述，丹参通脉胶囊能够明显改善脑缺血再灌注大鼠行为学评分，对于脑缺血再灌注具有明显的神经保护作用，其发挥作用的机制可能与减轻氧化应激及抑制炎症反应有关。