高效液相色谱法同时测定食用油中7种抗氧化剂的方法研究

张明先 杨燕

[摘要]本研究利用高效液相色谱同时测定食用油中没食子酸丙酯（PG）、没食子酸月桂酯（DG）、没食子酸辛酯（OG）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基对甲基苯酚（BHT）、2，6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚（Ionox-100）7种抗氧化剂的测定方法，样品中的抗氧化剂经正己烷溶解、乙腈萃取后，经C18柱分离，乙腈-1.5%乙酸溶液体系为流动相进行梯度洗脱，紫外检测器检测，外标法定量。选择线性范围在1～100mg/L，结果表明7种抗氧化剂呈良好的线性关系，相关系数r大于0.999，方法的测定低限为0.8～2.0mg/kg，回收率在89.3%～110.1%，变异系数在1.5%～4.9%。该方法准确、快速、重现性好，可用于大批量食用油检测中7种抗氧化剂的定量分析。

[关键词]抗氧化剂;高效液相色谱;食用油

中图分类号：TS227 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202003

食用油脂在生产、储藏、使用过程中容易发生酸败现象，从而导致油脂变质、品质下降，甚至产生对人体有害的物质[1]。为了阻止和延缓食用油的氧化，在油脂中添加抗氧化剂来阻止氧化反应的发生是目前食品生产企业常用的有效手段[2]。抗氧化剂在一定的范围内可以使用，但过量食用会对人体产生毒性[3-6]。鉴于其危害性，世界上很多国家都通过法规或者标准严格规定了抗氧化剂在食品中的限量。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[7]规定没食子酸丙酯（PG）最大使用量不能超过1g/kg，叔丁基对苯二酚（TBHQ）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基对甲基苯酚（BHT）最大使用量不能超过0.2g/kg。

《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》（GB 5009.32—2016）是测定抗氧化剂的国标方法[8]，但在实际使用中并不能实现多种抗氧化剂的完全分离和阳性鉴别，存在不足之处。因此，本文以食用油为研究对象，采用液-液萃取法进行样品提取、高效液相色谱配紫外检测器进行分离和检测，对前处理方法和测定条件进行了大量试验，最终建立了食用油中7种抗氧化剂的测定方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 样品选择

大豆油、玉米油样品：市售。

1.1.2 试剂与标准品

1.1.2.1 试剂

正己烷色谱纯、乙腈色谱纯：赛默飞世尔科技公司;乙酸：纯度99%，西亚试剂;纯水：屈臣氏集团（香港）有限公司。

1.1.2.2 标准品

PG、TBHQ、BHA、BHT：纯度分别为99.7%、99.2%、99.8%、99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司;Ionox-100、DG、OG：纯度分别为99.1%、99.0%、99.1%，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 主要仪器和设备

高效液相色谱仪配紫外检测器（Agilent 1260）、氮吹仪（MV5，lab Tech）、离心机（HC-3018）：安徽中科中佳科学仪器有限公司;漩涡混合（IKA）、有机微孔滤膜（0.22）：天津市津腾实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

混合标准储备液：分别称取7种抗氧化剂标准物质50.0mg，用乙腈溶解后，转移定容至50mL棕色容量瓶中，得到浓度为1 000mg/L的混合标准储备液，4℃避光保存。

混合标准使用液：移取適量体积的混合标准储备液至不同的10mL容量瓶中，用乙腈定容，得到浓度分别为1mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的混合标准使用液，临用现配。

1.3.2 样品前处理

称取油脂样品1.00g于具塞离心管中，加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋混匀2min，加入5mL正己烷饱和的乙腈溶液，涡旋提取2min，3 000r/min离心5min，收集乙腈层于试管中。再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，氮吹浓缩至近干，加2mL乙腈定容，过0.22?m有机微孔滤膜，待上机测定。

1.3.3 仪器工作条件

色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5?m）;检测波长：280nm;柱温：30℃;流动相：A为1.5%乙酸-水溶液（体积分数），B为乙腈;流速：1.0mL/min;进样量：10?L;洗脱梯度见表1。

2 试验条件优化

2.1 流动相选择

乙腈-水溶液和甲醇-水溶液分离效果对比。本试验比较了乙腈-水溶液和甲醇-水溶液分别作为流动相的分离效果。结果表明，当流动相为甲醇-水溶液时，DG和BHT出峰时间较晚且色谱峰严重重叠，不能实现完全分离;而流动相为乙腈-水溶液时，7种抗氧化剂的色谱峰分离效果较好，且出峰时间快、杂质干扰少。

乙酸-水溶液最佳浓度的确定。在相同的洗脱梯度下，本试验比较了不同乙酸-水溶液浓度对7种抗氧化剂总体分离效果的影响。结果表明，当乙酸-水溶液浓度为1.5%时，7种抗氧化剂实现完全分离，且峰形较好;当浓度继续增加时，OG和Ionox-100色谱峰出现重叠现象。因此，本试验选择乙酸-水溶液的最佳浓度为1.5%。

2.2 洗脱梯度选择

由于同时测定的抗氧化剂种类较多且保留时间相近，优选洗脱梯度对实现最佳分离效果较为重要。通过反复多次试验，综合考虑保留时间和分离效果，本试验最终确定了流动相为乙腈-1.5%乙酸水溶液条件下的梯度洗脱程序，见表1。

2.3 提取条件选择

《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》（GB 5009.32—2016）采用C18固相萃取柱或凝胶渗透色谱进行提取液净化，整个操作过程步骤繁琐、净化时间长且有机溶剂消耗量大，不利于日常大批量检测工作的开展。因此，本文在省去净化步骤的情况下与《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》（GB 5009.32—2016）进行了加标回收率对比试验，结果发现未受杂质明显干扰，且两者的加标回收率均在90%以上，达到了相同的提取效果。

3 结果与分析

3.1 标准曲线及线性关系

将本文1.3.1中配制的7种抗氧化剂混合标准使用液1mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L进行上机测定，得到标准液相色谱图，见图1。以浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到7种抗氧化剂的回归方程及相关系数，见表2。结果表明，当线性范围在1～100mg/L时，浓度与峰面积呈现较好的线性关系，7种抗氧化剂的相关系数均大于0.999。

3.2 检出限

以仪器噪声3倍的色谱峰高作为最低检出衡量指标，根据称样量、定容体积，计算出该方法中7种抗氧化剂的最低检出限，大大低于《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》（GB 5009.32—2016）中相应的检出限要求，结果见表2。

3.3 加标回收试验

分别以大豆油空白样品和玉米油空白样品为本底，各自做2.0mg/kg、20.0mg/kg、100.0mg/kg三个添加水平的回收试验，每个添加水平平行测定6次，结果见表3。由表3可知，大豆油和玉米油中三个添加水平的回收率在89.3%～110.1%，变异系数在1.5%～4.9%，符合准确度要求。

4 结  论

本试验利用高效液相色谱建立了同时测定食用油中PG、TBHQ、BHA、BHT、Ionox-100、DG、OG 7种抗氧化剂含量的方法。与《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》（GB 5009.32—2016）相比，该方法免去净化步骤，操作简便、试剂消耗少、分析速度快、分离效果好、准确度高、检出限低，适用于大批量食用油检测中7种抗氧化剂的快速定量分析。

参考文献

[1] 孟繁磊，蔡玉红，张国辉，等.UPLC测定食用油中10种抗氧化剂[J].中国油脂，2019，43（2）：134-137.

[2] 李银聪，阚建全，柳中.食品抗氧化剂作用机理及天然抗氧化剂[J].中国食物与营养，2011，17（2）：24-26.

[3] 张璐，孔祥红，李建华，等.固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定食品中13种抗氧化剂[J].分析试验室，2014，33（1）：43-47.

[4] 汪強，殷宪超，阮艺静，等.高效液相色谱法测定食用植物油中抗氧化剂的含量[J].理化检验-化学分册，2019，55（10）： 1215-1218.

[5] 左玉，张国娟，惠芳，等.食品抗氧化剂的研究进展[J].粮食与油脂，2018，31（5）：1-3.

[6] 朱胜华，车振明，向廷建.茶多酚对玉米油抗氧化的研究[J].食品工业，2011（9）：58-61.

[7] GB 2760—2014，食品安全国家标准 食品添加剂使用标准[S].

[8] GB 5009.32—2016，食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定[S].