藏药当佐对功能性消化不良大鼠胃肠激素水平的影响

李 雁，王晓喜，毕宏涛，陈 琦，魏立新，尚 靖，3*

（1.中国科学院西北高原生物研究所 青海省藏药药理学与安全性评价研究重点实验室，青海 西宁 810000；2.中国科学院大学，北京 100049；3.中国药科大学，江苏 南京 210000）

功能性消化不良（Functional dyspepsia，FD）是常见的功能性胃肠疾病之一，其全球发病率相差较大，据调查，亚洲人群患病率在8%～23%［1］，而国内FD 发病率在18%～45%，占到消化门诊的20%～50%［2-3］。由于该病反复发作，且目前临床使用的西药大多伴随严重的消化道和神经系统方面的副作用，所以从传统医药中探索其新的治疗方案已成为当前该疾病治疗药物的研究热点［4-8］。临床研究表明，藏药经典制剂当佐治疗功能性消化不良的有效率达到93.3%，且疗效优于其组成方剂安置精华散［9-12］。但是迄今为止，当佐治疗功能性消化不良的药理机制仍有待研究。本研究旨在通过测定功能性消化不良模型大鼠胃肠激素血浆胃动素（MTL），血清胃泌素（GAS）以及胃窦一氧化氮（NO）水平变化，从胃肠激素水平变化方面，探究当佐治疗功能性消化不良的作用机理。

1 材料

1.1 药物 安置精华散［石榴籽、肉桂、白豆蔻、筚菝、红花五味药按照《卫生部药品标准》1995 年版（藏药第一册）组方而成［13-14］；药材购自青海省富康医药有限责任公司，经中国科学院西北高原生物研究所杜玉枝研究员鉴定］；佐太（西藏藏医院，批号2012）；当佐（由质量比10%佐太和90% 安置精华散混合而成）；多潘立酮片（国药准字H20044163，批号170702，海南亚洲制药股份有限公司）。

1.2 动物 SPF 级SD 大鼠，雄性，体质量（220±50）g，由甘肃中医药大学提供，使用许可证号SYXK（甘）2015-0005，饲养温度20～25 ℃，湿度40%～60%，光照时间12 h；动物实验经中国科学院西北高原生物研究所实验动物伦理委员会批准。

1.3 试剂 胃泌素、胃动素ELISA 试剂盒（上海将来实业股份有限公司，批号201808）；NO 测定试剂盒（南京建成生物科技有限责任公司，批号20180823）；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物科技有限责任公司，批号20180719）；甲基橙（国药集团化学试剂有限公司，批号20140102）；碳酸氢钠（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司，批号20130320）；水合氯醛（分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号20180518）；生理盐水（国药准字H61020014，批号1708146B，西安京西双鹤药业有限公司）；PBS（博士德生物工程有限公司，批号09B16B30）。

1.4 仪器 酶标仪（Enspire SJZX-40，新加坡PerkinElmer公司）；离心机（3-18ks，德国Sigma 公司）；高通量组织匀浆研磨器（Scientz-48，宁波新芝生物科技股份有限公司）；电子天平［AL104，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；722 分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 造模及分组 SD 雄性大鼠72 只，称定体质量后随机分为空白组、模型组、多潘立酮组、安置精华散组、佐太组、当佐组，除空白组外，其余各组按文献所述稍加改良后造模［15］，在夹尾刺激同时单日正常饮食，双日禁食。造模及给药处理如下表所示［16］，各药物采用2%淀粉配置成相应浓度的混悬液，给药体积为10 mL/kg，每日1 次，连续给药2 周。

表1 实验动物分组及给药情况

2.2 体质量及进食量的测定 分别于造模前、造模结束（给药前）、给药结束时称定质量，得到各组大鼠体质量变化量。不规则饮食即单日正常饮食，双日禁食，在单日上午9：30 给予各组动物固定量的鼠食（固体，天平称重），至次日上午9：30 测定其余量，两者差值即该组大鼠该日进食量。

2.3 胃排空测定（胃内甲基橙含有率）参考文献［17-18］，各组大鼠于实验结束后禁食不禁水12 h，并给每只大鼠灌胃3 mL 0.1%甲基橙溶液，30 min 后5%水合氯醛麻醉大鼠，心脏采血；并迅速打开腹腔取下整胃，沿胃大弯剪开用并5 mL 生理盐水充分冲洗胃内容物于试管中，用5%碳酸氢钠溶液调pH 至6～6.5 后定容至10 mL，3 000 r/min离心10 min 取上清液；另以3 mL 0.1%甲基橙溶液加7 mL生理盐水混匀，离心取上清液作为标准液；420 nm 处测定吸光度值（OD），并按照下列公式计算出各组大鼠胃中甲基橙残留率，胃中甲基橙含有率＝（OD胃中甲基橙/OD标准液甲基橙）×100%。

2.4 胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）水平测定 ①血清样本处理，采血得到血液后静置使其自然凝固，在4 ℃下，3 000 r/min 离心20 min，收集上清即为待测血清；②血浆样本处理，选择乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）作为抗凝剂，将血液置于含有抗凝剂的采血管中混匀，并在4 ℃下，3 000 r/min 离心20 min，收集上清即为待测血浆。MTL、GAS 水平测定采用ELISA 法，具体步骤严格按试剂盒说明书进行操作。

2.5 胃窦NO 水平测定 将胃内容物充分清洗干净之后，自大鼠胃幽门括约肌处取得适量胃窦部组织，并用蒸馏水冲洗干净后用滤纸吸干多余水分后准确称重，按1∶9（质量/体积）的比例，加入PBS，冰水浴条件下破碎组织得到匀浆液，4 000 r/min 离心15 min，取上清液。蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝法，以硝酸还原酶法测定组织匀浆上清液的NO 水平，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.6 统计学分析 通过SPSS 21.0 进行数据处理，Graphpad prism 6.0 软件作图。数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 动物健康状态变化 造模之前，各组大鼠活泼好动、毛发整洁有光泽，精神状态上佳。造模后，空白组大鼠状态未见异常；各造模组大鼠从起初打斗剧烈，容易暴怒逐渐转变为打斗减弱，对环境变化敏感，易受惊，抱团蜷缩，消极对待打斗甚至停止挣扎，粪便增多，湿软并发出恶臭，大鼠肛周污秽，进食量明显增加；给药后，空白组大鼠状态仍未见异常，基本与实验前保持一致；模型组大鼠精神状态差，反应迟钝且暴躁易怒，多潘立酮，当佐和安置精华散组大鼠相比模型组，以上状态改善明显，打斗稍变剧烈，大鼠亦稍加活泼好动，抵抗增加，精神回佳，粪便状态恢复干燥、恶臭消失，进食量恢复正常；佐太组大鼠相比模型对照组状态未见明显改善。

3.2 体质量增长量 实验前各组大鼠体质量无明显差异，实验结束后各组大鼠体质量变化如图1 所示，空白组大鼠体质量增加，模型组大鼠体质量出现负增长（P＜0.01）；相比模型组，多潘立酮、当佐和佐太组大鼠体质量增长，增长量分别为41.93%、60.79%、34.04%（P＜0.05）；而安置精华散组大鼠在给药2 周后，体质量略有增加（7.81%），与模型组比较，差异无统计学意义。

图1 各组大鼠体质量增长量（，n=12）

3.3 各组胃甲基橙含有率（胃排空速度）如图2 所示，与空白组相比，模型组大鼠胃内甲基橙含有率降低12.00%（P＜0.05），胃排空速度减慢；多潘立酮、当佐、安置精华散和佐太组大鼠胃内甲基橙含有率相比模型组分别提高24.37%、23.42%、19.17%和6.20%（P＜0.05），即胃排空速度明显加快。

图2 各组大鼠胃内甲基橙含有率（，n=12）

3.4 各组血浆胃动素（MTL）水平 如图3 所示，给药后，模型组大鼠MTL 水平与空白组相比，降低9.98%（P＜0.01）；与模型组相比，多潘立酮组大鼠血浆MTL 水平增加9.70%（P＜0.01），恢复至正常水平；当佐、安置精华散和佐太亦增加大鼠血浆MTL 水平，但差异无统计学意义，增加量分别为7.33%、4.33%、4.38%。

图3 各组大鼠血浆胃动素（MTL）水平（，n=12）

3.5 各组血清胃泌素（GAS）水平 GAS 是一种与胃酸分泌有关的胃肠激素，其水平的变化与胃肠功能紧密相关。如图4 所示，给药后，相比空白组，模型组大鼠血清GAS水平上升13.59%（P＜0.01）；当佐、安置精华散和佐太作用与多潘立酮作用相似，血清GAS 水平都下降（P＜0.01），当佐组下降45.49%，安置精华散组下降48.04%，佐太组下降38.47%。

图4 各组大鼠血清胃泌素水平（，n=12）

3.6 各组胃窦NO 水平 NO 是大量存在于胃肠道的抑制性神经递质，对胃肠道运动具有抑制作用。如图5 所示，给药后，相比空白组，模型组大鼠胃窦NO 水平增加32.69%（P＜0.01）；与模型组相比，多潘立酮组与当佐组大鼠胃窦组织NO 水平分别降低37.42% 和26.93%（P＜0.01）；安置精华散和佐太组大鼠胃窦NO 水平也分别降低19.62%和11.43%，但与模型组相比，差异无统计学意义。

图5 各组大鼠胃窦NO 水平（，n=12）

4 讨论

当佐是藏医临床常用传统复方制剂，由安置精华散和佐太按比例配伍而成，其中，安置精华散是出自《四部医典》“泄泻症治疗”中的藏药经典方剂［13］，由石榴籽、肉桂、白豆蔻、荜菝、红花五味药组成［14］。佐太是珍宝类藏药中的核心成分，常作为药物佐剂。基于以上配伍组成，当佐具有温胃益火、化滞除湿、温通脉道、保肝健胃的功效，主要用于治疗消化不良、寒性腹泻、慢性肠胃炎等病症［9］。

作为藏医临床常用于治疗胃肠疾病的经典名方，当佐除临床研究证明对功能性消化不良具有良好治疗作用之外［10］，还有研究证明，当佐能够调节FD 肝郁脾虚大鼠的胃肠动力，降低胃内残留率，治疗应激诱导的功能性消化不良［16］。本研究利用夹尾刺激和不规则饮食联用复合因素建立功能性消化不良大鼠模型，选择MTL、GAS、NO 作为检测指标，初步探究当佐对该模型大鼠胃肠激素水平的影响。

其中，MTL 作为一种在多数哺乳动物上消化道表达的胃肠激素，在消化期间，呈周期性释放，主要作用于平滑肌上的胃动素受体，引起胃和上部小肠产生消化期综合肌电Ⅲ相并诱发胃强烈收缩和小肠明显的分节运动，导致平滑肌收缩，加速胃排空和小肠传输［19-20］。本研究中，模型组大鼠MTL 水平低于空白组，临床等效剂量下的当佐能够增加FD 大鼠血浆MTL 水平，增幅为7.33%，而安置精华散和佐太使FD 大鼠MTL 水平增幅分别为4.33%和4.38%，此结果表明当佐，安置精华散和佐太能增强FD 模型大鼠胃收缩，加速胃排空，改善FD 大鼠胃肠动力障碍，其中当佐作用效果最优。

GAS 是有促进胃酸分泌、增加胃窦收缩、加快胃排空的功能的一种胃肠激素，有研究发现不同程度胃排空障碍患者血清胃泌素升高，血清胃泌素也可以提示患者胃黏膜的状态，在胃肠道疾病状态的诊断中具有重要意义［22-22］。本研究中，模型组大鼠GAS 水平低于空白组，而给药后，当佐，安置精华散和佐太组大鼠GAS 明显降低（45.49%、48.04%、38.47%），说明给药后，各组大鼠胃肠动力恢复，胃窦收缩以及胃排空速度加快，FD 大鼠GAS 分泌量随之减少。

NO 是广泛存在于胃肠道的非胆碱能非肾上腺素能神经递质，是对胃肠道运动具有抑制作用且含量较高的神经递质，主要介导胃容受性舒张的反射活动，还具有对抗乙酰胆碱和MTL 对胃的收缩作用，影响胃的缩张，蠕动和排空［23-24］，其水平过高过低都会导致胃肠动力障碍。本研究中，模型组大鼠胃窦NO 高于空白组，而当佐能使FD 大鼠胃窦NO 水平降低26.93%，安置精华散与佐太分别降低19.62%和11.43%，此结果表明，当佐，安置精华散和佐太能通过减少NO 水平减弱MTL 对胃收缩的抵抗，加速大鼠胃肠平滑肌收缩，增加胃蠕动速度，提高胃肠动力，增加胃排空速度，其中当佐作用效果最优。

本研究通过对FD 大鼠胃动素、胃泌素、一氧化氮等指标的检测，对大鼠体质量、行为以及胃内甲基橙含有率的研究，发现对于夹尾刺激联合不规则饮食造成的功能性消化不良病症的治疗，临床等效剂量下，当佐作用效果最佳，与阳性药物多潘立酮无显著差别，且优于安置精华散和佐太。研究结果表明当佐及其配伍组成安置精华散治疗功能性消化不良的作用机制可能是增加大鼠MTL、减少GAS 和NO 等胃肠激素含量，从而引起大鼠胃收缩，蠕动和排空速度增加，最终改善大鼠胃肠动力障碍。其确切的分子机制，还有待深入探究。