水蛭滑石粉烫制工艺的优化及其质量分析

刘 敬，赵 斌*，刘晓鑫，曹 晖，王 琼

（1.中山火炬职业技术学院健康产业学院，广东 中山 528436；2.国家中药现代化工程技术研究中心中山健康产品分中心，广东 中山 528436；3.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006；4.国家中药现代化工程技术研究中心，广东 珠海 519085）

水蛭是一味具有破血通经、逐瘀消癓的常用动物类中药，现收载于2015 年版《中国药典》一部［1］，该药材使用历史悠久，始载于《神农本草经》，但因其药效峻猛、有小毒而被列为下品，临床上常将其炮制后再内服使用［2］。汉代《金匮玉函经》载有“熬”，为水蛭最早的炮制方法，宋代至清末的文献中还有不加辅料炮制（炒、煨、焙）、加辅料炮制（米制、石灰制、猪脂制、麝香制、盐制、油制）等10 余种方法，实质上均为加热处理［2-3］。

目前，市场上常见的水蛭炮制品有（净）水蛭、烫水蛭、酒炙水蛭等，其中烫水蛭主要以滑石粉为辅料，收载于自1977 年版起的历版《中国药典》、1988 年版《全国中药炮制规范》，以及广西、浙江等地方炮制规范中［4-6］。现代学者研究酒炙［7］、滑石粉加酒和姜炮制［8］、麦麸加酒炮制［9］、焙制、电热烘烤［10］等水蛭炮制新方法，也关注了炮制前后其水溶性蛋白的差异性［11］、不同炮制方法下的体外抗凝活性［12］。但国家和地方炮制规范对水蛭烫制工艺的温度、时间、滑石粉用量、翻炒速度等关键参数均无统一规定，大多凭药工主观经验来进行评价［4-6］，从而影响了炮制品质量。课题组前期制定了一些药材的滑石粉烫制工艺规范［13-15］，本实验在此基础上采用星点设计-效应面法优化水蛭滑石粉烫制工艺，并分析了炮制前后其理化指标的变化，以期为相关标准的制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器 CY-20 型电热型炒药机（江阴市祝塘明科机械厂）；2500C 型粉碎机（永康市艾泽拉电器有限公司）；101-2AB 型鼓风烘箱（天津泰斯特仪器有限公司）；ATX224 电子分析天平（日本岛津公司）；A300 全自动氨基酸分析仪（德国曼默博尔公司）；K9860 全自动凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）；DCY-12G 氮吹仪（青岛海科仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 水蛭购于广州汉草医药科技有限公司（批号20170409），经中山火炬职业技术学院赵斌教授鉴定为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigraWhitman。滑石粉（陕西圣瑞医药科技有限公司，批号20170518）；牛纤维蛋白原（100 mg，批号F20170412）、凝血酶（1 000 U，CAS 号9002-04-4）（合肥博美生物科技有限责任公司）；氨基酸标准品溶液（德国曼默博尔公司，含18 种氨基酸，胱氨酸浓度为50 nmol/mL，其余均为100 nmol/mL）。乙醇、氯化钠、三羟甲基氨基甲、盐酸等试剂均为分析纯；水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 烫制工艺优化

2.1.1 因素水平确定 翻炒速度为非连续性数据，故本实验将其设定为12 r/min。以烫制温度（A）、烫制时间（B）、滑石粉用量（C）为影响因素，各因素5 个水平，见表1。

2.1.2 烫制品制备 取20 份净水蛭段，每份50 g。先将滑石粉加入炒药机内，待机器达到规定温度后再投入药材，翻炒规定时间（12 r/min）后立即取出，筛去滑石粉，放凉，即得。

表1 因素水平

2.1.3 评价指标测定

2.1.3.1 粉碎率 取烫制品20 g，粉碎30 s 后过100 目筛，收集，称定过100 目筛粉末的质量，计算粉碎率。

2.1.3.2 醇溶性浸出物 按2015 年版《中国药典》四部2201 的醇溶性浸出物测定法中的热浸法进行测定，浸出溶剂为稀乙醇。

2.1.3.3 抗凝血酶活性 按2015 年版《中国药典》一部水蛭项下方法［1，16］进行测定。

2.1.4 数据处理 “2.1.3”项下指标测定结果越大，炮制效果越好，故本实验按公式dmax＝（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）进行转换，求得“归一值”［17］，再计算几何平均数，得总评“归一值”（OD），公式为OD＝（d1d2…dn）1/n（n＝3）。结果见表2。

表2 试验设计与结果

2.1.5 模型拟合及方差分析 通过Design-Expert 8.0.5b版软件对表2 数据进行多元线性回归和二项式拟合，得方程为OD＝-0.57+0.036A+0.027B-0.031C-0.15AB-0.091AC-0.094BC-0.090A2-0.11B2-0.011C2（R2＝0.955 7，P＜0.000 1）。方差分析显示，各因素影响程度依次为烫制温度（A）＞滑石粉用量（C）＞烫制时间（B），其中炮制温度具有显著影响（P＜0.05）；所得方程拟合度良好，可信度高（R2＝0.955 7，P＜0.000 1）。

2.1.6 响应面分析 见图1。综合考虑实际炮制过程中的可操作性，确定最优工艺为烫制温度195 ℃，烫制时间3.5 min，滑石粉用量30%，OD为0.641。

2.1.7 验证试验 根据优化工艺进行3 批验证试验，测得平均OD为 0.633，与预测值 0.641 接近（偏差为-1.25%），表明工艺稳定可行。生品和烫制品见图2。

2.2 质量评价

2.2.1 水分、醇溶性浸出物、含氮量、抗凝血酶活性测定 按照2015 年版《中国药典》方法进行测定［1］，结果见表3。由此可知，烫制后上述指标均较生品下降。

表3 水分、醇浸出物、含氮量、抗凝血酶活性测定结果（n=2）

2.2.2 氨基酸含有量测定 参考文献［18］报道。精密称取水蛭粉末约30 mg，置于水解管中，加入6 mol/L 盐酸15 mL、苯酚3～4 滴，于冷冻机中冷却3 min 后抽真空，充氮气，重复3 次，在充氮气状态下封口，再于烘箱中加热至110 ℃水解22 h，取出，冷却至室温，过滤水解液，滤液转移至50 mL 量瓶中，水解管用水洗涤3～5 次，洗液合并至量瓶中，加水定容至刻度，精密吸取1.0 mL 至试管中，40 ℃下减压干燥，残渣加2 mL 水溶解后干燥，最后蒸干，精密加入pH 2.2 的柠檬酸钠缓冲液1 mL，振摇溶解，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

图1 各因素响应面图

图2 水蛭烫制前后形态

将对照品、供试品溶液注入氨基酸分析仪中，外标法计算含有量，结果见表4。由此可知，烫制品中氨基酸平均总量为51.71%，含全部16 种氨基酸，以谷氨酸含有量最高，达8.61 mg/100 mg，占氨基酸总量的16.7%；含有苏氨酸等7 种人体必需氨基酸，总量为18.4 mg/100 mg，占氨基酸总量的35.6%。

表4 各氨基酸含有量测定结果（n=2）

3 讨论

本实验采用星点设计-效应面法，选择烫制温度、烫制时间、滑石粉用量3 个关键参数，对水蛭滑石粉烫制工艺进行优化，可为其炮制规范的制定提供合理依据。总评“归一值”是多指标数据处理的一种较科学的方法，能客观量化地体现所有指标，从而使模型具有更好的预测性［17］，本实验将烫制工艺中的粉碎率、醇溶性浸出物、抗凝血酶活性等指标综合起来，以该方法来表达最终效应，所得结果更科学合理。

生水蛭质韧难碎，气味腥臭，严重影响其直接使用，故自古就对其进行加热处理，其中滑石粉烫是最主流的炮制方法，其目的主要有去腥矫味、使药材质地酥脆、利于粉碎、降低毒性等［2］。本实验结果显示，滑石粉烫制后水蛭含水量下降，质地松泡，腥臭味明显下降，有利于临床应用。