玉屏风颗粒对变应性鼻炎大鼠Th17/Treg 平衡及相关细胞因子的影响

许江涛 ，劳梓钊，张丽娟，廖小红，阎 雪，吴依娜，李得堂*

（1.广州中医药大学，广东 广州 510405；2.广州中医药大学附属中山医院，广东 中山 528400；3.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

变应性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）为机体由变应原所引起的由免疫球蛋白E 介导的过敏性疾病。近十年来，发病率呈明显上升的趋势［1］，疾病发展到后期，较多患者往往会诱发为过敏性哮喘。目前AR 的发病机制尚未完全明确，以往研究显示，AR 的发病机制主要是由Th1/Th2 免疫的失衡所引起［2］，随着深入研究发现，AR 的发病过程中还涉及到Th17/Treg 细胞之间的失衡［3］

AR 属于中医学“鼻鼽”范畴，临床常分为肺气虚型、脾气虚型等，其中肺气虚型较为常见，肺气虚，卫表不固，外邪乘虚而入所致。故临床上常用经方玉屏风散为基础治疗AR，显示出较好的临床疗效。玉屏风散出自《丹溪心法》，是益气固表的经典名方。为深入探讨玉屏风对AR 大鼠Th17/Treg平衡及相关细胞因子的调控作用，本课题组采用卵清蛋白（OVA）诱导建立AR 大鼠模型，观察玉屏风对AR 大鼠Th17/Treg 平衡及相关细胞因子的影响，进一步研究玉屏风治疗AR 的作用机制。

1 材料

1.1 动物 40 只SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，体质量180～220 g，购自广州中医药大学实验动物中心［许可证号SXCK（粤）2018-0034］。实验于广州中医药大学的ABSL-2 实验室饲养［实验室备案书编号为粤广动实备GZL0 004 号］完成，本实验开展经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 玉屏风颗粒组方药材为炙黄芪、防风、炒白术。取上述3 味药材，先加8 倍量水提取1.5 h，过滤，药渣再加6 倍量水提取1 h，过滤，合并2 次提取液，滤液减压浓缩至相对密度为1.15～1.20 稠膏，与适量蔗糖粉、糊精混匀，沸腾喷雾制成颗粒，干燥，整粒，分装。每克颗粒相当于1 g生药量，由广州中医药大学第一附属医院制剂室提供（批号20180301）；氯雷他定片（拜耳医药上海有限公司，批号JS07620）；卵清蛋白（OVA，广州捷倍斯生物科技有限公司，批号1706GYD005）；Foxp3、RORγt、β-actin 引物（擎科新业生物技术有限公司）；TGF-β1 试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号144463021）；β-actin 抗体（美国Gene Tex 公司，批号GTX109639）；Foxp3 抗体（美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号14577382）；RORγt 抗体（美国Santa Cruz 公司，批号sc-293150）；IL-17 试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批号R190822-170a）。

1.3 仪器 酶标仪（美国Bio-Tek 公司）；PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；蛋白印迹仪（美国Protein Simple 公司）。

2 方法

2.1 造模 大鼠随机分为正常组、模型组。参考文献方法造模［4］，共两个阶段，基础致敏［致敏液为0.3 mg OVA、30 mg A1（OH）3，溶于1 mL 生理盐水］，腹腔注射隔天1 次，共7 次，以及局部激发（致敏液为5%OVA 溶液），连续14 d滴鼻（100 μL）。

2.2 分组及给药 在完成基础致敏阶段后，将模型组大鼠随机分为模型组、氯雷他定组（0.9 mg/kg）［5］、玉屏风颗粒组（12、6 g/kg）［6-7］。在第二激发阶段期间，药物组每次局部激发前30 min灌胃给药，另外两组以生理盐水灌胃替代。

2.3 AR 行为学评分 造模第27 天末次鼻腔激发后30 min 内，观察每组大鼠鼻部过敏症状（鼻痒、喷嚏、流涕等表现）为主的行为学并记录评分，评分标准参考表1。指标评分后累计总分大于5分，即判为造模成功［8］。

表1 AR 行为学评分标准Tab.1 AR behavioral scoring criteria

2.4 鼻黏膜组织病理学观察 实验结束当天，每组随机选取2 只，将大鼠颈椎脱臼处死后，收集鼻黏膜组织用于制片，分别用HE 和AB-PAS 染色，显微镜下观察鼻黏膜组织病理学改变。

2.5 大鼠血清中IL-17、TGF-β1 水平的检测 实验结束当天，使用水合氯醛麻醉大鼠，首先通过眼底静脉丛取血，离心收集血清，储存于-80 ℃。参照试剂盒说明书，按步骤检测大鼠血清中IL-17、TGF-β1 水平。

2.6 RT-PCR 法测定大鼠鼻黏膜组织中Foxp3、RORγtmRNA 表达 实验结束当天，将每组剩余大鼠处死取新鲜鼻黏膜组织10 mg，加入TRIzol 裂解液充分研磨，提取总RNA 以及逆转录合成cDNA，以cDNA 为模板进行实时荧光PCR 检测Foxp3、RORγtmRNA 表达。反应条件，95 ℃、3 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40 个循环。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算相关基因mRNA 的相对表达量。引物序列见表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

2.7 大鼠鼻黏膜组织中Foxp3、RORγt 蛋白表达 实验结束当天，每组随机选取2 只，将大鼠颈椎脱臼处死后，收集鼻黏膜组织，加入RIPA 裂解液及PMSF，充分裂解提取总蛋白，BCA 法测定蛋白量，进行SDS-PAGE 电泳，转膜后封闭1 h，加入一抗Foxp3（1∶1 000）、RORγt（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）孵育过夜，二抗室温孵育1 h，加ECL 化学发光剂于蛋白印迹仪成像，用Image J图像分析软件对图像进行分析，计算RORγt/Foxp3蛋白比值。

2.8 统计学分析 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析；计量资料以（）表示；多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；以P≤0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 AR 行为学总分、打喷嚏次数、挠鼻次数的比较 如图1 显示，与正常组比较，模型组大鼠挠鼻次数、打喷嚏次数和AR 行为学总分升高（P＜0.05），而且模型组行为学总分大于5 分，表明此次AR 大鼠模型造模成功。与模型组比较，玉屏风颗粒组（12、6 g/kg）大鼠挠鼻次数、打喷嚏次数和行为学总分均降低（P＜0.05）。

3.2 玉屏风颗粒对AR 大鼠鼻黏膜组织的影响 如图2～3 显示，正常组上皮细胞排列整齐、少量炎症细胞浸润、上皮层内无明显杯状细胞化生。模型组黏膜结构不完整、部分纤毛上皮、基底膜脱落、大量炎症细胞浸润、上皮层内大量杯状细胞化生，杯状细胞体积增大且分泌旺盛。玉屏风颗粒组（12 g/kg）上皮细胞结构完整、少量炎症细胞浸润、杯状细胞数量明显下降。而玉屏风颗粒组（6 g/kg）上皮细胞较为完整、炎症细胞浸润和杯状细胞增生情况有轻微改善。

3.3 玉屏风颗粒对AR 大鼠血清中IL-17、TGF-β1水平的影响 如图4 显示，与正常组比较，模型组大鼠血清中的IL-17 水平升高，TGF-β1 水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，玉屏风颗粒组（12、6 g/kg）大鼠血清中的IL-17 水平降低，TGF-β1 水平升高（P＜0.05）。

图1 各组大鼠挠鼻、打喷嚏等行为学总分的比较（n=8）Fig.1 Comparison of scores of scratching，sneezing and other behavior in each group（n=8）

图2 各组鼻黏膜组织的HE 染色（×200）Fig.2 HE staining of nasal mucosa in each group（×200）

图3 各组鼻黏膜组织的AB-PAS 染色（×200）Fig.3 AB-PAS staining of nasal mucosa in each group（×200）

3.4 玉屏风颗粒对AR 大鼠鼻黏膜组织中Foxp3、RORγtmRNA 表达的影响 如图5 显示，与正常组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织RORγtmRNA 表达升高，Foxp3 mRNA 表达降低（P＜0.05）。与模型组比较，玉屏风颗粒组（12、6 g/kg）大鼠鼻黏膜组织Foxp3 mRNA 表达升高，RORγt mRNA 表达降低（P＜0.05）。

3.5 玉屏风颗粒对AR 大鼠鼻黏膜组织中Foxp3、RORγt 蛋白表达的影响 如图6 显示，与正常组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织RORγt/Foxp3 蛋白表达比例升高（P＜0.05）。与模型组比较，玉屏风颗粒组（12、6 g/kg）大鼠鼻黏膜组织RORγt/Foxp3蛋白表达比例降低（P＜0.05）。

图4 各组大鼠血清中IL-17、TGF-β1 水平（n=8）Fig.4 Serum levels of IL-17，TGF-β1 in rats of each group（n=8）

图5 各组大鼠鼻黏膜组织中Foxp3、RORγt mRNA 表达（n=4）Fig.5 mRNA expression of Foxp3，RORγt in rats nasal mucosa in each group（n=4）

图6 各组大鼠鼻黏膜组织中Foxp3、RORγt 的蛋白表达（n=3）Fig.6 The protein expression of Foxp3，RORγt in nasal mucosa of rats in each group（n=3）

4 讨论

变应性鼻炎发生过程中不仅涉及Th1/Th2 免疫平衡，还包括Th17/Treg 免疫平衡，随着对变应性鼻炎发病机制的研究不断增多，Th17/Treg 免疫平衡为治疗AR 的机制研究和临床治疗提供了研究思路。Th17 和Treg 细胞是效应T 细胞亚群，分化自CD4+T 细胞。RORγt（Th17 细胞特异性转录因子）是Th17 细胞分化的前提［9］，IL-17 是Th17 细胞主要效应细胞因子，亦称为前炎性因子［10］。Treg 细胞具有免疫抑制功能，在维持免疫耐受中发挥关键作用，Foxp3（Treg 细胞特异性转录因子）的表达水平影响Treg 的功能变化［11-12］，TGF-β1（Treg 细胞主要分泌细胞因子）能促进表达Foxp3 的Treg 分化［13］。Th17 和Treg 细胞在功能是相互拮抗的［14］，两者之间在一定的平衡情况下，才能维持机体免疫状态相对稳定。Foxp3 和RORγt的平衡被破坏可能会诱导主要由Th17 细胞参与的致炎的T 淋巴细胞反应［15］。揭示IL-17、TGF-β1、Foxp3、RORγt 与Th17/Treg 免疫平衡密切相关。

玉屏风散最早出自《医方类聚》，后在《丹溪心法》有详细记载，为中医经典名方，对多种疾病有较好疗效，主要由黄芪、白术、防风三味中药组成，其中黄芪补脾肺之气，白术健脾益气，防风走肌表而散风邪，整体发挥益气固表，扶正祛邪的功效。AR 属于中医“鼻鼽”范畴，该病的病因多数为肺气虚，卫表不固，外邪入侵等所致，该病亦属于过敏性疾病，具有反复发作，不易根治的特点，而玉屏风在临床上用于治疗AR 患者的效果好，对比西药治疗，具有复发率低［16］，毒副作用低，长期疗效较为稳定的优势，为临床首选方剂。现代药理研究证明，玉屏风散能明显改善AR 大鼠炎性症状，具有抗过敏作用［17］。目前尚未有关于玉屏风对AR 大鼠Th17/Treg 平衡及相关细胞因子影响的研究。

本实验采用OVA 诱导建立的AR 大鼠模型作为药效评价模型，较好模拟AR 典型临床特征［18］。本次实验结果显示，OVA 诱导的AR 大鼠出现明显的鼻黏膜炎性症状，鼻黏膜组织炎性细胞浸润较多，大量杯状细胞化生及分泌亢进，黏液分泌增加，含较高含量的黏蛋白，鼻黏膜组织重塑特征明显；血清中IL-17 水平明显上升，而TGF-β1 水平明显降低；鼻黏膜Foxp3 表达明显下降，而RORγt表达明显上升；鼻黏膜RORγt/Foxp3 蛋白表达比例明显升高。提示IL-17、TGF-β1、Foxp3、RORγt表达水平在变应性鼻炎的疾病发展过程具有关键作用，在Th17/Treg 平衡中以Th17 免疫反应占优势。玉屏风干预后，可有效缓解AR 大鼠炎性症状和鼻黏膜组织炎症细胞浸润，减少杯状细胞化生和黏液分泌，降低血清的IL-17 水平和提高TGF-β1 水平，同时降低鼻黏膜RORγtmRNA 及蛋白水平表达，升高鼻黏膜Foxp3 mRNA 及蛋白水平表达，使Th17/Treg 免疫平衡向Treg 免疫反应占优趋势转化，从而调节AR 大鼠Th17/Treg 免疫失衡。

综上所述，玉屏风对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜炎症症状有明显的缓解作用，其作用机制可能与调节Th17/Treg 平衡及相关细胞因子相关。