甘草苷对感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠的止咳作用机制及抗氧化作用的研究
2020-10-14熊富良张雪琼周炼炼李心愿孙雅妮
陈 千,熊富良*,张雪琼,周炼炼,李心愿,孙雅妮,刘 芮,唐 寒
(1.武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉 430070; 2.武汉健民中维医药有限公司,武汉 430056;3.中南民族大学药学院,武汉 430074)
沙参麦冬汤为治疗肺阴虚类咳嗽的经典名方药,出自清医吴鞠通的《温病条辨》,该复方由北沙参、麦冬、玉竹、天花粉、白扁豆、甘草、桑叶七味中药材组成;沙参麦冬颗粒是在经典名方沙参汤的基础上,按照创新药的要求,应用现代科学技术研制而成的中药新品种;具有清肺养阴,润燥生津的功能,临床用于肺阴亏耗类亚急性与慢性咳嗽的治疗.方中北沙参、麦冬为君药,甘寒生津、清养肺胃;玉竹、天花粉共为臣药,清肺养阴、润燥养胃;白扁豆、甘草、桑叶三药调和合为佐使,培土生津、泻火和中、散热散燥;诸药配伍共奏清养肺胃,生津润燥之功效,乃甘寒之法[1].现代药理学研究表明:沙参麦冬汤具有治疗干眼症、咳嗽变异性哮喘、肺阴虚咳嗽、抗肿瘤等功效,尤其是在抗肺癌方面具有很好的开发应用前景[2-6].感染后咳嗽(post infectious cough,PIC)又称感冒后咳嗽,指各种病原体所致的急性呼吸道感染症状消失后,但咳嗽仍迁延不愈的症状,通常持续3~8周,常伴有气道高反应,属于亚急性咳嗽的一种,为呼吸科门诊常见疾病[7-8].但目前无沙参麦冬颗粒治疗感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠的相关研究,因此本文首次构建感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠模型来深入探讨研究沙参麦冬颗粒中甘草苷的止咳疗效及抗氧化的作用机制.
本课题在前期实验研究中,通过构建感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠模型来筛选沙参麦冬颗粒的止咳活性部位,研究结果表明该复方的乙酸乙酯部位浸膏具有较好的止咳作用,进而深入研究其止咳活性物质基础,采用反复硅胶柱色谱法、半制备高效液相色谱法等多种色谱分离技术对乙酸乙酯部位浸膏进行分离纯化,并结合理化性质、核磁、质谱等鉴定手段对分离所得的12个化合物进行结构鉴定,其中包括甘草苷.甘草具有补脾益气、清热止咳、抗炎、抗氧化等功效,是我国重要的传统中药,在中医上被尊称为“国老”,甘草苷为甘草的黄酮类成分,亦具有抗炎、止咳等生物活性[9-10].因此,提示甘草苷可能为沙参麦冬颗粒治疗感染后咳嗽(肺阴虚证)的重要止咳活性物质,然而甘草苷的止咳及抗氧化作用的具体机制尚不清楚,本实验旨在进一步探讨甘草苷是否通过减少炎性细胞的浸润、炎性细胞因子、炎性介质的释放及表达,进而减少气道炎性反应环境,降低咳嗽高敏感性来达到止咳的效果;是否通过提高肺组织的抗氧化酶(SOD、CAT)的活性来清除过量的活性氧自由基,减少过量的自由基在体内堆积以达到抗氧化的作用;为沙参麦冬颗粒临床上治疗肺阴虚类亚急性咳嗽提供客观科学依据.
1材料与方法
1.1实验动物
Balb/c小鼠(SPF级),体质量16~24 g,雌鼠(60只),由华中农业大学提供,实验动物许可证号SCXK(鄂)2015-0019.
1.2药品与试剂
北沙参、麦冬、玉竹、天花粉、白扁豆、甘草、桑叶均购于安徽敬道药业有限公司,并严格按照中国药典的要求鉴定药材,均为合格药材.红金龙香烟(湖北中烟工业有限责任公司,焦油量、烟气烟碱量、烟气一氧化碳量分别为10、1、12 mg);烟熏箱(捷贝有限公司,透明型,长、宽、高分别为72、53、44 cm);甲状腺片(山东省惠诺药业有限公司);内毒素(上海源叶生物科技有限公司);辣椒素(成都瑞芬思生物科技有限公司);孟鲁司特钠片(杭州默沙东制药有限公司);甘草苷(成都瑞芬思生物科技有限公司);4%多聚甲醛(武汉赛维尔生物科技有限公司);HE染色液(武汉赛维尔生物科技有限公司);生理盐水(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司);羧甲基纤维素钠(CMC-Na,国药集团化学试剂有限公司);中性树胶(国药集团化学试剂有限公司);小鼠TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE、SOD、CAT、MDA等进口ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司).
1.3实验仪器
多功能诱咳引喘仪(上海欣软信息科技有限公司);微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);JJ-12J型脱水机(武汉俊杰电子有限公司);JB-P5型包埋机(武汉俊杰电子有限公司);RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);Nikon Eclipse E100型正置光学显微镜(日本尼康);电热恒温培养箱(武汉一恒苏净科学仪器有限公司);HT-111B型恒温摇床(上海赫田科学仪器有限公司);XB220A型电子分析天平(瑞士普瑞赛斯);JY98-IIIN型细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司);低温高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);RT-6100全自动酶标仪(美国雷杜).
1.4实验方法
1.4.1小鼠造模与给药 适应性饲养5 d后,开始造模.其中空白组(10只)不作任何处理,自由饮水进食;余下50只小鼠,每次烟熏时,将其先放入自制的两个烟熏箱中(25只小鼠·箱-1),箱子右上角放置一艾灸盒,第1~10 d上下午分别点燃4支香烟放入艾灸盒中的卫生纸上,盖上盖子,其上再以毛巾覆盖,防止烟雾溢出,30 min后取出小鼠,2次·d-1,持续10 d;第11、14、17 d上午以浓度为0.4 mg·mL-1的LPS滴鼻,按10 μL·10g-1体重计算滴鼻量;第11~19 d下午以浓度为30 mg·mL-1的甲状腺素混悬液灌胃,每只小鼠的灌胃剂量为0.3 mL;并分别于第12、13、15、16、18、19 d晚上以浓度为1×10-4mol·L-1的辣椒素雾化诱咳,每次雾化时间为3 min,1次·d-1.于造模第20 d,使用多功能诱咳引喘仪对造模小鼠进行辣椒素诱咳激发实验,若小鼠频繁喷嚏、颈部伸向前、腹肌抽搐、张口等特征性体位出现,且3 min内咳嗽次数约10次左右,即提示造模成功[7].
造模成功后,随机分为模型组、阳性组、甘低组、甘中组、甘高组;空白组和模型组均给予等量的生理盐水灌胃,阳性组给予1.2 mg·kg-1的孟鲁司特钠混悬液(混悬在0.5%CMC-Na中)灌胃,甘草苷低、中、高组分别给予25、50、100 mg·kg-1的甘草苷混悬液(同上)灌胃,每组10只;各组灌胃剂量均为0.1 ml·10 g-1体质量,1次·d-1,连续给药7 d.
1.4.2小鼠行为学观察与体质量监测 仔细观察每组小鼠在造模前后的皮毛光泽、有无脱毛、大便干湿状态、自由活动状态、精神状况以及有无哮鸣音等.
适应性饲养完毕后,在造模期间第1 d测一次体质量作为基础值,烟熏期间每10 d测一次体质量,烟熏后每5 d测一次体质量,造模完毕后,给药第7 d再测一次体质量,记录好实验数据,观察各组小鼠的体质量变化.
1.4.3小鼠咳嗽敏感性测定 末次给药24 h后,取1×10-4mol·L-1的辣椒素溶液作为诱咳液,加入多功能诱咳引喘仪的雾化器中,雾化3 min,雾化停止后再观察2 min,记录各组小鼠在5 min内的首咳时间及咳嗽次数.
1.4.4小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量测定 咳嗽敏感性测定完毕后,采用眼球取血法收集各组小鼠的外周全血,将收集好的全血标本放入低温高速冷冻离心机中,设置离心条件为低温4 ℃、4 500 r·min-1、离心25 min,离心完毕后取其上清液即为小鼠血清,将小鼠血清置于-20 ℃下冻存.采用ELISA法测定各组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量,操作过程及方法均严格按照试剂盒说明书进行.
1.4.5小鼠肺组织病理学观察 各组小鼠眼球取血完毕后,立即解剖取出部分肺组织放入4%多聚甲醛中固定,常规取材脱水后,石蜡包埋切片,并用HE染色液染色.脱水封片后用光学显微镜观察支气管及肺组织炎性细胞浸润情况,支气管黏膜上皮细胞和肺泡壁损害情况等病理变化.
1.4.6小鼠肺组织中SOD、CAT、MDA的水平含量测定 各组小鼠眼球取血完毕后,立即取出部分肺组织放入冻存管中于-20 ℃下冻存.用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)冲洗肺组织,除去其残留血液,称重后将肺组织剪碎.将剪碎的肺组织与对应体积的PBS缓冲液加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨,以制备10%的肺组织匀浆,最后将匀浆液于5000×g条件下离心10 min,取其上清液检测.采用ELISA法检测各组小鼠肺组织中SOD、CAT、MDA的水平含量,操作过程及方法均严格按照试剂盒说明书进行.
2结果与分析
2.1甘草苷对小鼠行为学及体质量的影响
在造模期间,空白组小鼠不受影响,小鼠性格温顺,毛发光泽,反应灵敏,进食主动,无哮鸣音;与空白组比较,模型组小鼠胆小易惊,毛发枯黄无光泽、易脱毛,肌肉松弛,大便稀溏,不喜进食,倦怠蜷卧,有哮鸣音;其他各组小鼠状态与模型组小鼠无明显差异.在给药期间,空白组小鼠的精神活动状态较造模期无明显变化;模型组小鼠的精神活动状态较造模期亦无明显变化;与模型组比较,阳性组及甘草苷低、中、高组小鼠的精神活动状态均有所好转,小鼠反应能力均逐渐灵敏轻快,肌肉逐渐紧实,毛发逐渐有光泽,亦逐渐喜主动进食.
由表1可知,在造模期间,空白组小鼠不受影响,其体质量稳健增长;与空白组比较,其他各组小鼠体质量均逐渐明显下降,差异均具有极其显著性统计学意义(P<0.001).在给药期间,空白组小鼠体质量依旧稳健增长;与空白组比较,模型组小鼠体质量回升缓慢,差异具有显著性统计学意义(P<0.01);其他给药组小鼠的体质量均逐渐回归正常水平,且差异均无统计学意义.与模型组比较,其他给药组小鼠的体质量均逐渐回归正常水平,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结果表明:采用烟熏+LPS滴鼻+甲状腺素灌胃+辣椒素诱咳能引起小鼠体质量的明显减轻,成功模拟了肺阴虚证形体消瘦的病理生理特征;甘草苷低、中、高剂量组均可改善小鼠的精神活动状态并有效治疗小鼠的肺阴虚病征.
表1 各组小鼠体质量变化(n=10)Tab.1 Changes of body mass in each group (n=10)
2.2甘草苷对小鼠咳嗽敏感性的影响
由表2可知,各组小鼠经辣椒素雾化诱咳后,均有不同程度的咳嗽.空白组小鼠的咳嗽潜伏期较长,并出现少量咳嗽;模型组、其他给药组小鼠的咳嗽潜伏期及咳嗽次数呈不同程度的缩短和增多.与空白组比较,模型组、阳性组、甘低组、甘中组小鼠的咳嗽潜伏期均不同程度的明显缩短,差异均具有显著性统计学意义(P<0.01或P<0.001);甘高组小鼠的咳嗽潜伏期稍有缩短,但差异无统计学意义;模型组、阳性组、甘低组、甘中组、甘高组小鼠的咳嗽次数均不同程度的明显增多,差异均具有极其显著性统计学意义(P<0.001).与模型组比较,阳性组、甘中组、甘高组小鼠的咳嗽潜伏期均不同程度的明显延长,差异均具有极其显著性统计学意义(P<0.001);甘低组小鼠的咳嗽潜伏期稍有延长,但差异无统计学意义;阳性组、甘低组、甘中组、甘高组小鼠的咳嗽次数均不同程度的明显减少,差异均具有极其显著性统计学意义(P<0.001).结果表明:甘草苷中、高剂量组可明显延长感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠的咳嗽潜伏期;甘草苷低、中、高剂量组可明显减少感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠的咳嗽次数;甘草苷可呈剂量依赖性降低感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠的咳嗽高敏感性,以达到养阴止咳的目的.
表2 各组小鼠咳嗽敏感性测定Tab.2 Determination of cough sensitivity in each group
2.3甘草苷对小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量的影响
由表3、表4可知,与空白组比较,模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE
水平含量均显著增高,差异均具有极其显著性统计学意义(P<0.001);阳性组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、IgE水平含量稍有增高,TGF-β1水平含量稍有降低,但差异均无统计学意义;甘低组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均增高较多,差异均具有显著性统计学意义(P<0.01或P<0.001);甘中组小鼠血清中TNF-α水平含量增高较多,差异具有极其显著性统计学意义(P<0.001),IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量有所增高,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);甘高组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2水平含量有所增高,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),TGF-β1、IgE水平含量稍有增高,但差异均无统计学意义.与模型组比较,阳性组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均显著降低,差异均具有显著性统计学意义(P<0.01或P<0.001);甘低组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、IgE水平含量有所降低,差异均具有统计学意义(P<0.05),TLR2、TGF-β1水平含量稍有降低,但差异均无统计学意义;甘中组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均降低较多,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);甘高组小鼠血清中TNF-α、IL-13、IgE水平含量均显著降低,差异均具有极其显著性统计学意义(P<0.001),IL-6、TLR2、TGF-β1水平含量均降低较多,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结果表明:甘草苷可呈剂量依赖性减少小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量.
2.4甘草苷对肺组织病理变化的影响
由图1可知,空白组小鼠肺组织基本正常;模型组小鼠肺组织的肺泡壁薄,可见轻微增厚,黑色箭头周围可见少量炎性细胞浸润;阳性组、甘低组、甘中组、甘高组小鼠肺组织的肺泡壁、支气管等结构较清晰完整,上皮细胞形态较正常,肺泡壁较薄,未见明显增厚,未见明显炎症反应,与空白组小鼠肺组织无明显差异.结果表明:甘草苷可有效减轻感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠肺组织中的炎症反应.
表3 小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13水平含量的测定(n=5)Tab.3 Determination of TNF-α,IL-6 and IL-13 levels in serum of mice (n=5)
续表3
表4 小鼠血清中TLR2、TGF-β1、IgE水平含量的测定(n=5)Tab.4 Determination of TLR2,TGF-β1 and IgE levels in serum of mice (n=5)
A) 空白组;B) 模型组;C) 阳性组;D) 甘低组;E) 甘中组;F) 甘高组;A)~F) HE×200,标尺线长度为100 μmA) Control group; B) Model group; C) Positive group; D) Glycyrrhizin low-dose group; E) Glycyrrhizin median-dose group; F) Glycyrrhizin high-dose group; A)-F) HE×200;scale bar:100 μm图1 各组小鼠肺组织病理变化Fig.1 Pathological changes of lung tissue in mice
2.5甘草苷对小鼠肺组织中SOD、CAT、MDA水平含量的影响
由表5可知,与空白组比较,模型组小鼠肺组织中SOD、CAT水平含量均显著下降,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),MDA水平含量显著升高,差异具有极其显著性统计学意义(P<0.001);阳性组小鼠肺组织中SOD水平含量稍有下降,差异具有统计学意义(P<0.05),CAT、MDA水平含量稍有下降,但差异均无统计学意义;甘低组、甘中组小鼠肺组织中SOD、CAT水平含量均有所下降,但差异均无统计学意义,MDA水平含量均有所升高,但差异均具有极其显著性统计学意义(P<0.001);甘高组小鼠肺组织中SOD、CAT水平含量均稍有下降,MDA水平含量稍有升高,但差异均无统计学意义.与模型组比较,阳性组小鼠肺组织中SOD、CAT水平含量均明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05),MDA水平含量显著下降,差异具有极其显著性统计学意义(P<0.001);甘低组、甘中组小鼠肺组织中SOD水平含量均有所上升,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),CAT水平含量均稍有上升,但差异均无统计学意义,MDA水平含量均有所下降,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);甘高组小鼠肺组织中SOD水平含量有所上升,差异具有统计学意义(P<0.05),CAT水平含量有所上升,但差异无统计学意义,MDA水平含量显著下降,差异具有极其显著性统计学意义(P<0.001).结果表明:甘草苷可有效增高小鼠肺组织中SOD的水平含量,并呈一定剂量依赖性降低小鼠肺组织中MDA的水平含量.
表5 小鼠肺组织中SOD、CAT、MDA水平含量的测定(n=5)Tab.5 Determination of SOD,CAT and MDA levels in lung tissues of mice(n=5)
3讨论
目前关于肺阴虚慢性咳嗽动物模型的建立方法,主要以烟熏(SO2熏)+甲状腺素灌胃+利血平灌胃为主[11-12];感染后咳嗽动物模型的建立方法,主要以烟熏+LPS滴鼻+辣椒素雾化为主[13];病征结合模型即感染后咳嗽(肺阴虚证)大鼠模型的建立方法为烟熏+LPS滴鼻+甲状腺素灌胃+辣椒素雾化[7],但无感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠模型的建立方法,参考感染后咳嗽(肺阴虚证)大鼠模型的建立方法,该模型小鼠的建立方法依旧为烟熏+LPS滴鼻+甲状腺素灌胃+辣椒素雾化,但通过调整烟熏香烟的支数、LPS滴鼻的剂量以及甲状腺素灌胃的剂量来构建.故本研究先采用纸烟烟熏法诱导小鼠形成气道高反应,然后用LPS滴鼻诱导小鼠气道产生炎性反应、释放炎性介质,再灌服甲状腺素使之阴虚燥热、形体消瘦、灼伤阴津,最后定期用辣椒素雾化诱导小鼠咳嗽,复制出感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠的病征结合动物模型.
研究表明,有多种炎性细胞、炎性介质及细胞因子参与形成气道炎性反应,如TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE等表达增加.TNF-α是细胞因子调节网络的启动因子,为主要由巨噬细胞分泌的一类肽类炎性介质,可有效激活中性粒细胞、淋巴细胞、白介素等一系列细胞因子及炎性介质的产生,使气道产生炎性环境,启动肺组织炎性反应,产生细胞因子的瀑布效应[14];IL-6为主要由活化的T细胞和成纤维细胞产生的一种多效细胞炎症因子,可介导炎性反应效应而加剧炎症瀑布反应[15];IL-13为由2型辅助型淋巴细胞(Th2细胞)产生的一种多效细胞炎症因子,可诱导B细胞的增殖及合成IgE类受体,具有促进气道上皮细胞产生表达嗜酸性粒细胞趋化因子作用,进而加剧气道炎性环境[16];Toll样受体(toll-like receptor,TLR)最早发现于果蝇体内,TLRs家族是介导炎症反应的关键受体蛋白,TLR2是TRLs家族中研究最早分布最广泛的成员,受到内外源性配体刺激后,可通过刺激触发骨髓分化因子88依赖性信号传导来激活核转录因子(NF-κB),NF-κB活化后可进一步启动TNF-α、IL-1、IL-8等一系列炎性细胞因子的释放表达,来参与各种炎症疾病过程[17].TGF-β1为一种多功能的细胞因子,是一种强有力的促成纤维细胞分裂因子,可使肺成纤维细胞发生过度增殖和分化,进而趋化炎性细胞和单核巨噬细胞,并促进其合成释放TNF-α、IL-1、IL-6等炎性细胞因子,来参与炎症反应[14,18].IgE主要通过激活肥大细胞来改变气道反应性,并参与介导变应性炎性反应,使气道平滑肌呈易激性、易痉挛状态,进而诱发气道高反应性的形成,同时可引起气道渗出增加、上皮损伤等其它气道炎性反应的发生,进一步加剧气道高反应性及咳嗽高敏感性[7].健康人体内不会过多积累自由基,如果体内抗氧化平衡系统遭到破坏,则体内会堆积过量自由基,进而引发一系列过氧化反应,加速衰老;抗氧化酶是抗氧化系统中不可或缺的重要组成部分,可有效清除机体内过量的活性氧自由基、活性氧类、过氧化物的生成,保护机体免受自由基损伤从而延缓衰老;SOD、CAT均是体内至关重要的抗氧化剂,SOD是机体抵抗氧化损伤的重要保护屏障之一,可有效促进自由基的清除,CAT可有效分解机体内的过氧化氢(H2O2),释放新生态氧气,进而在体内起到解毒及保护巯基的作用;MDA是脂质过氧化的代谢产物,其含量高低与脂质过氧化反应呈正向,可直接反映机体的脂质过氧化水平,代表着组织氧化损伤程度[19-20].
综上所述,3种不同浓度的甘草苷均可有效减少感染后咳嗽(肺阴虚证)小鼠的咳嗽次数,其中甘草苷中、高剂量组可有效延长小鼠的咳嗽潜伏期,降低其气道高敏感性;其作用机制可能为减少小鼠气道中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE等细胞因子及炎性介质的释放,进而减轻气道感染性及变态性炎性反应环境来降低咳嗽高敏感性,减少对咳嗽中枢的刺激来达到止咳的目的.3种不同浓度的甘草苷均可有效提高小鼠肺组织中SOD的含量,减少小鼠肺组织中MDA的含量,来改善体内抗氧化平衡系统的紊乱,有效清除机体中的过量自由基,提高机体内抗氧化酶的含量,以减轻氧化损伤来达到抗氧化的目的.