碧根果壳总黄酮的提取工艺优化和抗氧化活性研究

康坤，王俊斌,2,通信作者，王海凤，王凤堂，王耀国，王昊

碧根果壳总黄酮的提取工艺优化和抗氧化活性研究

康坤1，王俊斌1,2,通信作者，王海凤3，王凤堂1，王耀国1，王昊1

（1. 天津农学院 基础科学学院，天津 300384；2. 天津农学院 化学实验教学中心，天津 300384；3. 天津农学院农业分析测试中心，天津 300384；）

以碧根果壳为材料，采用超声辅助浸提法提取总黄酮。以总黄酮提取率为评价指标，在单因素试验结果的基础上，利用正交法对提取工艺条件进行优化，并考察碧根果壳黄酮提取物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、超氧阴离子自由基的清除能力。结果表明：在乙醇浓度为65 %、料液比为1∶30、提取温度为40 ℃、提取时间为50 min的条件下，碧根果壳总黄酮提取率达到最高。在一定浓度范围内，碧根果壳黄酮提取物的浓度越大，其抗氧化能力也越高。

碧根果壳；总黄酮；正交试验；抗氧化能力

碧根果又名薄壳山核桃、长寿果，是美国山核桃的果实，原产于美国与墨西哥，是世界十大坚果之一[1]。碧根果的果肉营养丰富，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、碳水化合物、多种矿物质元素和维生素，同时还具有补肾健脑、补中益气、润肌肤、乌须发等药用功效，因此成为备受青睐的营养和休闲食品[1-2]。但对于碧根果的果壳，绝大多数作为垃圾进行处理，既污染环境又浪费资源。作为食用坚果的副产物，坚果壳资源丰富，其中的黄酮、多酚、多糖和色素类化合物的活性功能及应用开发价值正受到越来越多的关注[3-4]。近年来，利用微波和超声辅助方法，一些研究者对坚果壳中多酚、多糖和黄酮类物质的提取工艺进行了研究，并证明坚果壳提取物有较强的抗氧化活性[5-8]。但相关研究还比较少，对坚果壳的生物活性物质提取及功能研究亟待进一步加强。

本研究以碧根果壳为原料，乙醇为溶剂，超声波辅助提取碧根果壳中的总黄酮，用正交试验对提取工艺进行优化。同时，以维生素C为对照，就碧根果壳中总黄酮对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、超氧阴离子自由基的清除能力为指标进行研究，为碧根果壳的开发利用提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料和试剂：碧根果购自当地超市，手工剥壳、去杂，粉碎后过60目筛。芦丁（Rutin）标准品：中国药品生物制品检定所。无水乙醇、氢氧化钾、DPPH、硫酸亚铁、邻苯三酚、维生素C均为分析纯。

仪器：HHS-11-4数显电热恒温水浴锅；UV-2100紫外分光光度计；TDL80-2B台式离心机；FA1204B电子天平；R-100型旋转蒸发仪；DF-15型台式连续投料粉碎机；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 芦丁标准曲线的绘制

准确称取芦丁20 mg置于100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容。精密称取芦丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL比色管中，加60%乙醇10 mL，加5%亚硝酸钠溶液 1 mL，放置6 min，加1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min。分别取10 mL置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度[9]。在510 nm波长下测定吸光度，以吸光度对芦丁浓度（mg/mL）进行线性回归，得方程：＝8.358 9＋0.02，＝0.994 4。

1.3 碧根果壳总黄酮的提取及测定

称取适量的碧根果壳粉末置于250 mL瓶中，加入一定浓度乙醇溶液超声加热提取一定时间，将提取后的溶液过滤，弃掉滤渣，并在4 000 r/min条件下离心5 min，对上清液进行水浴加热并浓缩，浓缩至提取物质量浓度约为1 g/mL，备用。将滤液定容至100 mL，按照1.2方法测其吸光度值，带入回归方程求得提取液中黄酮的质量浓度[10]，按公式（1）计算总黄酮提取率：

式中：——总黄酮质量浓度，mg/mL；

——总黄酮提取液体积，mL；

——粉末质量，mg

1.4 单因素试验

在超声波辅助提取条件（固定超声功率200 W）下，分别考察乙醇浓度（55%、65%、75%、85%、95%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL）、提取温度（30、40、50、60、70 ℃）、提取时间（10、20、30、40、50 min）4个因素对提取效果的影响。

1.5 正交试验

根据单因素试验结果，以总黄酮提取率为评价指标，以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素3个水平进行L9（34）正交试验，因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素及水平

1.6 DPPH自由基清除能力测定

于2.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液中分别加0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的提取液1 mL，反应30 min后在波长517 nm处测吸光度，记为i，同时测2.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液与1.0 mL乙醇混合液的吸光度记为c，2.5 mL无水乙醇与不同质量浓度的1 mL提取液混合液的吸光度记为b。同时，以同浓度维生素C作阳性对照，碧根果壳总黄酮对DPPH自由基的清除率按公式（2）计算[11-12]。

1.7 超氧阴离子自由基的清除能力测定

配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的样品提取液，待用。在5支具塞刻度试管中依次加入0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）2.5 mL，置于25 ℃水浴中保温20 min，分别加入0.2 mL不同质量浓度样品提取液，0.98 mmol/L NBT溶液0.6 mL和10 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，立即加入0.1 mL 8 mol/L HCl终止反应，于530 nm处测定吸光度（x），空白对照组以等体积溶剂代替样品提取液，吸光度记为0，阳性对照组以相同体积和浓度的维生素C溶液代替样品[7,13]。按公式（3）计算超氧阴离子自由基清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对总黄酮提取效果的影响

由图1可知，在试验范围内，随着提取溶剂浓度的升高，总黄酮提取率呈先上升后下降的趋势，乙醇浓度为65%时，提取率最高。随后，提取率随着乙醇浓度升高而下降，原因可能是较高浓度的乙醇导致非黄酮类的一些脂溶性物质溶出，造成体系中黄酮含量下降。

图1 乙醇浓度对提取效果的影响

2.1.2 料液比对总黄酮提取效果的影响

由图2可知，当料液比在（1∶10）～（1∶20）时，随着料液比的升高，碧根果壳黄酮提取率逐渐提高，当料液比为1∶20时，黄酮含量达最大值，继续增大料液比则提取率下降。原因可能是随着材料继续增加，杂质随之增加，导致溶解在体系中的黄酮比例下降[7]。

图2 料液比对提取效果的影响

2.1.3 提取温度对总黄酮提取效果的影响

由图3可知，随着提取温度的升高，总黄酮提取率呈先上升后下降的趋势，当温度为50 ℃时，黄酮提取率达到最大值。随着温度的升高，热效应使分子的运动加速，提取率开始增大，但随着温度再继续升高，部分黄酮成分受到高温破坏[14]。因此，温度高于50 ℃时，黄酮含量逐渐下降。

图3 温度对提取效果的影响

2.1.4 提取时间对总黄酮提取效果的影响

由图4可知，在10～30 min时，提取物中总黄酮含量随提取时间的增加而明显升高，30～ 40 min时只缓慢升高，并不明显。随着超声提取时间的继续增加，总黄酮提取率下降。较长的提取时间可使黄酮尽可能提取完全，但也容易引入杂质，并造成时间、能源成本的增加。因此，提取时间在30～40 min 比较合适。

图4 提取时间对提取效果的影响

2.2 正交试验结果

通过正交试验确定了最佳提取条件。由表2可知，超声提取碧根果壳总黄酮的最佳工艺条件为A1B3C1D3，即乙醇浓度65%，料液比1∶30，提取温度40 ℃，提取时间50 min。此工艺下总黄酮提取率为1.932%。对试验数据进行分析，计算各因素所对应的极差值，可知各因素对试验指标影响的顺序为：提取温度（C）＞乙醇浓度（A）＞ 提取时间（D）＞料液比（B）。由此可以看出，在碧根果壳黄酮的提取过程中，提取温度和提取溶剂（乙醇）的浓度对提取效果影响较大。

表2 正交试验结果

2.3 碧根果壳总黄酮提取物的抗氧化能力

2.3.1 DPPH自由基清除能力评价

DPPH法稳定性和灵敏度较好，其乙醇溶液呈紫色，遇到抗氧化物质时，能使其溶液颜色逐渐消失，即可根据DPPH的褪色程度来间接评价待测物的抗氧化活性[15]。从图5可以看出，在碧根果壳总黄酮提取液质量浓度20～100 μg/mL范围内，清除DPPH自由基的能力随提取液质量浓度的增加而增加，在所有质量浓度下，提取物的DPPH自由基清除能力均大于维生素C对照组。当提取物质量浓度为100 μg/mL时，清除率最高，达到91.5%。说明碧根果壳总黄酮有较强的清除DPPH自由基的能力。

图5 碧根果壳提取物对DPPH自由基的清除能力

2.3.2 超氧阴离子自由基清除能力评价

研究表明，黄酮类化合物对超氧阴离子自由基有很好的清除作用[16]。由图6可知，碧根果壳提取物清除超氧阴离子自由基的能力随质量浓度的增加而增加，当提取物质量浓度达到100 μg/mL 时，清除率最高，达到80.9%。虽然比维生素C的清除率低，但是也能说明碧根果壳总黄酮有较强的清除超氧阴离子自由基的能力。

图6 碧根果壳提取物对超氧阴离子自由基的清除能力

3 结论

本研究采用超声波辅助乙醇溶液浸提法提取碧根果壳中的总黄酮，由单因素试验和正交优化筛选出最佳的工艺条件为：乙醇浓度65 %，料液比1∶30，提取温度40 ℃，提取时间50 min。此条件下总黄酮提取率达到1.932%。以DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除能力为评价指标，表明碧根果壳总黄酮提取物具有较高的抗氧化活性，其抗氧化能力随提取物质量浓度的升高而增强。因此，碧根果壳可以作为黄酮提取资源加以开发和利用。本研究探索了碧根果壳中总黄酮的提取条件和抗氧化活性，为进一步推进坚果壳的综合利用及产品开发提供了一定的理论依据。

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Optimization of extraction and antioxidant activity of total flavonoids in pecan shell

KANG Kun1, WANG Jun-bin1, 2,Corresponding Author, WANG Hai-feng3, WANG Feng-tang1,WANG Yao-guo1, WANG Hao1

（1. College of Basic Sciences, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Chemistry Experiment Teaching Center, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 3. Center for Agricultural Analysis and Measurement, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In this study, the pecan shell was used as the material to extract total flavonoids by ultrasonic-assisted extraction.Taking the extraction rate of total flavonoids as the evaluation index, on the basis of single-factor test results, the orthogonal extraction method was used to optimize the extraction process conditions, and the scavenging ability of total flavonoids from the pecan shell to 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）and superoxide anion free radical was estimated.Theresults showed that the extraction rate of the total flavonoids reached the highest under the conditions of ethanol concentration of 65%, material-liquid ratio of 1∶30, extraction temperature of 40 ℃ and extraction time of 50 minutes.Within a certain concentration range, the greater the concentration of the flavonoids extract of pecan shell is, the higher its antioxidant capacity will be.

pecan shell; total flavonoids; orthogonal design; antioxidant activity

1008-5394（2020）03-0074-05

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.017

TS 202.3

A

2020-04-13

天津农学院大学生创新创业训练计划项目（201810061243）；天津农学院教育教学研究与改革项目（2018-B-05）

康坤（1997-），女，本科在读，主要从事生物活性物质提取和功能方面的研究。E-mail：2310909343@qq.com。

王俊斌（1979-），男，副研究员，博士，主要从事生物活性物质提取和功能方面的研究。E-mail：419647768@qq.com。

责任编辑：宗淑萍