肺结核患者临床特征与外周血流式细胞亚群的相关性分析

毛毅 曾义岚 吴桂辉 江智豪 范琳

机体的免疫功能低下是引起潜伏性结核感染及活动性结核病的因素之一[1]。宿主对结核分枝杆菌(MTB)免疫应答主要由巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、淋巴细胞等完成，这些细胞可介导机体的固有及适应性免疫应答[2]，其中T淋巴细胞介导的适应性免疫在结核病的发展及转归起着关键性的作用[3]。肺结核患者由于存在着耐药、并发症、年龄、联合用药等复杂因素的影响，使得不同患者的免疫应答可能存着较大差异，患者的免疫应答差异可能影响患者的疗效，因此研究肺结核患者临床特征对于免疫应答的影响也可能成为未来结核病免疫治疗研究的切入点。本研究连续性收集同济大学附属上海市肺科医院的1000例肺结核患者的临床信息及流式细胞(T淋巴细胞亚群及NK细胞)检测结果，通过统计学分析，以便能发现肺结核患者的各种临床特征与流式细胞亚群检测结果之间是否存在相关性。

资料和方法

一、研究对象

回顾性、连续性收集同济大学附属上海市肺科医院2019年1月1日至5月25日收治的确诊及临床诊断为肺结核的患者1000例。肺结核的诊断根据《WS 288—2017肺结核诊断》[4]进行。

二、仪器和方法。

1.仪器：采用Epics XL型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

2.方法：抽取患者空腹静脉血2 ml，肝素抗凝，进行荧光标记，100 μl全血与CD3-异硫氰酸荧光素(FITC)/CD16CD5藻红蛋白(PE)荧光双标记单克隆抗体(法国Immunotech公司)室温反应20 min，加入Optilyse C溶血素(法国Immunotech公司)500 μl充分混匀，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤重悬细胞，检测血中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD3-CD16+CD56+细胞(NK细胞)阳性表达率。

三、记录与收集

记录患者所有外周血流式细胞染色结果、性别、年龄、初/复治、有无并发症、有无并发肺外结核、痰抗酸染色涂片、呼吸道标本(痰液和纤维支气管镜冲洗液)的BACTEC MGIT 960液体培养及药物敏感性试验(简称“药敏试验”)、MTB分子生物学检测(包括GeneXpert MTB/RIF检测和MTB DNA/RNA检测)、胸部CT检查(肺部病灶范围、空洞数量、最大空洞直径)。根据《中国耐多药和利福平耐药结核病治疗专家共识(2019年版)》[5]的规定， MDR-TB(耐多药结核病)是指结核病患者感染的MTB体外药敏试验证实至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核病。XDR-TB(广泛耐药结核病)是指结核病患者感染的MTB体外药敏试验证实同时对异烟肼和利福平耐药，还对任何喹诺酮类药品耐药，以及3种二线注射类药品(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1种耐药的结核病。初治肺结核：(1)尚未开始抗结核药品治疗的患者;(2)正进行标准化疗方案用药而未满疗程的患者;(3)不规则化疗<1个月的患者。复治肺结核:(1)初治失败的患者；(2)规则用药满疗程后痰菌又复阳的患者;(3)不规律化疗>1个月的患者;(4)慢性排菌患者。

四、纳入患者的临床特征

1.一般情况：1000例肺结核患者，男625例，女375例，年龄为11～92岁，中位年龄33岁，年龄分布以20～<40岁为主，占44.0%。确诊肺结核(以病原学、病理学结果作为确诊依据)479例；临床诊断[以病原学(包括细菌学、分子生物学)检查为主，结合流行病史、临床表现和胸部影像学特征、相关的辅助检查及鉴别诊断等，进行综合分析做出诊断]521例。初治肺结核769例，复治肺结核231例；有1种或以上并发症的患者170例，其中并发糖尿病123例、并发慢性阻塞性肺疾病(COPD)78例、并发支气管扩张56例、并发乙型病毒性肝炎45例、并发肺外结核者320例。

2.患者的临床特征：1000例患者中，呼吸道标本抗酸染色涂片阳性298例，阳性率29.8%。BACTEC MGIT 960培养阳性479例，阳性率47.9%；药敏试验结果提示MDR-TB/XDR-TB 77例，GeneXpert MTB/RIF检测阳性339例，阳性率33.9%。呼吸道标本MTB的DNA/RNA检测阳性423例，阳性率42.3%。

3. 胸部CT检查重点观察如下指标。(1)肺部病灶范围：无病灶累及肺野55例，累及1个肺野197例，累及2个肺野129例，累及3个肺野173例，累及4个肺野88例，累及5个肺野37例，累及6个肺野321例。(2)肺部空洞数量：无空洞780例，1个空洞138例，2个空洞48例，3个空洞16例，4个空洞13例，5个空洞1例，6个及以上空洞4例。(3)最大空洞直径：在肺部有空洞的220例患者中，收集每例患者肺部最大的空洞直径进行分析，其中最大值为9.03 cm，最小值为0.10 cm，中位数为1.67 cm。

五、统计学处理

1.变量赋值标准：(1)呼吸道标本抗酸染色分级赋值。-=0；+=1；++=2；+++=3；++++=4。(2)病灶范围分级赋值。0个肺野=0；1个肺野=1；2个肺野=2；3个肺野=3；4个肺野=4；5个肺野=5；6个肺野=6。(3)分子生物学检测(包括GeneXpert MTB/RIF检测、MTB DNA/RNA检测)赋值。设定任何一项分子生物学检测阳性=1；所有标本的分子生物学检测阴性=0。(4)其他各项赋值。男性=1；女性=0。初治=1；复治=0。无肺外结核=0；并发肺外结核=1。无并发症=0；有并发症=1。药敏试验全敏感=0，MDR-TB/XDR-TB=1。为了解各年龄段患者与流式细胞亚群数量的相关性，将患者分为0～岁、20～岁、40～岁及≥60岁4个年龄组进行分析；引入4个哑变量：age1(0～<20岁=1，≥20岁=0)、age2(20～<40岁=1，<20岁及≥40岁=0)、age3(40～<60岁=1，<40岁及≥60岁=0)、age4(≥60岁=1，<60岁=0)。

2. 统计学方法:所有资料采用Excel 2013建立数据库，数据采用Eviews 8.0软件进行统计学分析。分别以流式细胞亚群计数“CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD3-CD16+CD56+细胞(NK细胞)”为因变量；以各临床特征“性别、年龄、初/复治、有无并发症、并发肺外结核、呼吸道标本抗酸染色涂片、呼吸道标本的BACTEC MGIT 960液体培养及药敏试验、MTB分子生物学检测(包括GeneXpert MTB/RIF检测、MTB DNA/RNA检测)、胸部CT检查(肺部病灶范围、空洞数量、最大空洞直径)”为自变量。采用最小二乘法建立多元线性逐步回归模型，通过逐一剔除无明显影响的临床特征，最终建立多元线性逐步回归模型，分析以上临床特征对外周血流式细胞计数的影响。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、 各项临床特征与CD3+ T细胞的相关性分析

通过各项临床特征与外周血CD3+T细胞检测值进行多元线性逐步回归分析，最终模型显示肺部病灶范围与CD3+T细胞数量呈负相关，回归系数-0.255，P<0.05，有统计学意义；表明肺部病灶范围越大，CD3+T细胞数量越低。抗酸染色涂片阳性与CD3+T细胞数呈负相关，回归系数-0.499，P<0.05，有统计学意义；表明随着抗酸染色涂片阳性程度越高，其CD3+T细胞数量越少(表1)。其余临床特征经过统计学检验P值均>0.05，无统计学意义，经逐步回归分析逐一剔除；证明这些临床特征与CD3+T细胞的表达水平无明显相关性。该项统计学检验的回归模型R2=0.558，拟合度可，且模型的P<0.05，证明模型具有统计学意义。

二、 各项临床特征与CD4+ T细胞的相关性分析

通过各项临床特征与外周血CD4+T细胞检测值进行多元线性逐步回归分析，最终模型显示：0～<20岁年龄段(age1)与患者CD4+T细胞有相关性，回归系数-4.710，P<0.05，有统计学意义，表明0～<20岁年龄段患者CD4+T细胞低于其他年龄段患者。患者的性别与CD4+T有相关性，回归系数-2.150，P<0.05，表明在肺结核患者中男性患者CD4+T细胞数低于女性患者；此外，患者的呼吸道标本MTB的分子生物学检测结果与CD4+T淋巴的检测数值有相关性，回归系数1.433，P<0.05，表明分子生物学检测阳性的患者其CD4+T细胞比值高于分子生物学检测呈现阴性的肺结核患者(表2)。其余临床特征经过统计学检验P>0.05，无统计学意义，经逐步回归分析逐一剔除，证明这些临床特征与CD4+T细胞的表达水平无明显相关性。该统计模型显示回归模型R2=0.334，模型的P<0.05，证明该项统计模型具有统计学意义。

三、 各项临床特征与CD8+ T细胞的相关性分析

通过各项临床特征与外周血CD8+T细胞检测值进行多元线性逐步回归分析，最终模型显示：初治/复治与CD8+T细胞数量有相关性，回归系数1.247，P<0.05，有统计学意义，即初治患者CD8+T细胞数量大于复治患者；抗酸染色涂片阳性同CD8+T细胞数量呈正相关，回归系数0.442，P<0.05，有统计学意义，表明随着抗酸染色涂片阳性程度越高，其CD8+T细胞数量越高(表3)。其余临床特征经过统计学检验P>0.05，无统计学意义，经逐步回归分析逐一剔除，证明这些临床特征与CD8+T细胞的表达水平无明显相关性。该统计模型显示回归模型R2=0.331，模型的P<0.05，证明该项统计模型具有统计学意义。

四、各项临床特征与NK细胞的相关性分析

通过各项临床特征与外周血NK细胞检测值进行多元线性逐步回归分析，最终模型显示：是否并发肺外结核与NK细胞有相关性， 回归系数0.375，P<0.05，有统计学意义，证明并发肺外结核患者NK细胞低于未并发肺外结核患者(表4)。其余临床特征经过统计学检验P>0.05，无统计学意义，经逐步回归分析逐一剔除，证明这些临床特征与NK细胞的表达水平无明显相关性。该统计模型显示回归模型R2=0.894，模型的P<0.05，证明该项统计模型具有统计学意义。

讨 论

由于MTB是胞内寄生菌，在结核病发病过程中宿主的T细胞(CD3+、CD4+、CD8+)及NK细胞在宿主免疫抵抗MTB感染中发挥着重要的作用[6]。MTB与宿主之间的相互作用决定着疾病的进展，由此导致不同的患者可有不同的临床特征及免疫表达特征[7]。本研究旨在通过大样本统计学分析肺结核患者的临床特征与其外周血免疫细胞表达水平之间的相关性。

表1 1000例肺结核患者各项临床特征与外周血CD3+ T细胞的多元线性逐步回归模型

表2 1000例肺结核患者各项临床特征与外周血CD4+ T细胞的多元线性逐步回归模型

表3 1000例肺结核患者各项临床特征与外周血CD8+ T细胞的多元线性逐步回归模型

表4 1000例肺结核患者各项临床特征与外周血NK细胞的多元线性逐步回归模型

一、肺结核患者临床特征与CD3+T细胞数量的相关性

1．肺部病变范围越大，CD3+T细胞数量越少：Morais-Papini[8]的研究指出肺部病变的程度会影响保护性细胞因子的分泌水平。Fan等[9]的研究显示重症空洞性肺结核患者的CD3+CD4+T细胞数量下降。本研究显示肺部病灶范围与CD3+T细胞的数量呈负相关，肺部病灶范围越大，则CD3+T细胞数量越少，与前面的研究结果一致。因此，肺结核患者肺部病灶的病理损伤程度越重，越不利于患者的保护性细胞免疫水平的发挥。 T淋巴细胞亚群在结核病患者外周血中分布失衡，可能与疾病的发展相关，两者互为因果[10]。

2．呼吸道标本抗酸染色涂片阳性程度越高，其CD3+T细胞数量越低：以往很少有学者关注抗酸染色涂片与患者T淋巴细胞数量的关系，而抗酸染色涂片的结果一定程度上反映了肺结核患者体内感染MTB的载荷。本研究发现抗酸染色涂片与CD3+T细胞数量呈负相关，表明随着抗酸染色涂片阳性程度增加，其CD3+T细胞数量越低，患者免疫功能下降越明显。因此研究痰抗酸染色与CD3+T淋巴细胞数量的相关性具有重要意义。

二、肺结核患者临床特征与CD4+ T细胞数量的相关性

众所周知，CD4+T细胞在控制结核感染中起着非常重要的作用，以CD4+T细胞特异性免疫应答及其通过分泌γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)刺激负载MTB的巨噬细胞活化构成了抗结核免疫应答的中心环节。

1.患者的年龄与CD4+T细胞表达有关：林俊锦等[11]报道老年人肺结核组CD4+T细胞及CD4+/CD8+比值低于与青壮年组及健康组。井楠等[12]通过40例肺结核患者的研究发现老年患者的血清CD4+T细胞明显低于青年、中年患者。但本研究则显示0～<20岁年龄段患者CD4+T细胞数量低于其他年龄段患者。分析其原因：青少年肺结核患者的肺部病灶及免疫受损的程度可能严重于成年人及中老年患者。

2.肺结核患者中男性患者CD4+T细胞数低于女性患者：Hussain等[13]通过50例患者研究表明性别差异并未影响T淋巴细胞亚群；但是本次研究通过大样本数据分析发现，肺结核患者CD4+T细胞数量男性低于女性患者。

3.分子生物学检测阳性肺结核患者的CD4+T细胞数量高于阴性者：本次研究还发现，分子生物学检测阳性患者CD4+T细胞数量大于分子生物学检测阴性患者，表明当机体被MTB感染，机体通过调节，提高CD4+T细胞数量，以增加IFN-γ的分泌抑制结核的免疫逃逸。因此分子生物学检测阳性可能与机体的CD4+T细胞数量密切相关。

三、肺结核患者临床特征与CD8+ T细胞数量的相关性

1.复治肺结核患者CD8+T细胞数量低于初治患者：黄丽静等[14]对76例肺结核患者的研究发现复治患者的CD8+T淋巴细胞数量大于初治患者，但来自沈洁等[15]的研究显示：初/复治患者CD8+T淋巴细胞无明显变化。本次研究的数据显示，复治肺结核患者CD8+T细胞数量低于初治患者；这与国外研究结论一致，CD8+T细胞在MTB感染初期肺中的细胞数量会出现升高[16]。从理论上分析，复治肺结核患者病情普遍偏重、耐药结核病发生率高，且经过初治治疗失败、复发等过程的因素可能引起体内某种调控机制影响CD8+T细胞增殖，从而导致细胞数量下降。

2.呼吸道标本抗酸染色涂片阳性程度增加，其CD8+T细胞表达的数量增加：本研究的数据还显示抗酸染色涂片阳性程度与CD8+T细胞数量呈正相关，即随着抗酸染色涂片阳性程度增加，其CD8+T细胞表达的数量增加，这个结论与国外某些学者的研究相似。Guglielmetti等[17]观察到肺结核患者CD8+T细胞的阳性数值较健康对照组增加。而Yang 等[18]的研究则认为，尽管在MTB感染期间CD8+T细胞反应强烈且持续，但CD8+T细胞不能完全识别受感染的巨噬细胞，导致CD8+T细胞的免疫保护效应受到影响。此外，活动性肺结核患者CD8+T细胞升高的原因还可能在于：(1)体内的细胞毒性CD8+T细胞反应性扩增以抵抗MTB的入侵；(2)CD4+T细胞数量下降导致的CD8+T细胞数量升高。以上研究结论及推测仍然需要进行深入研究予以证实。

四、肺结核患者临床特征与NK细胞的相关性

NK细胞是CD3-CD16+CD56+的细胞亚群，可介导宿主的固有免疫反应。Ye 等[19]研究发现，NK细胞在肺结核患者和健康对照组中差异无统计学意义。本次研究结果则提示，并发肺外结核患者NK细胞数量低于未并发肺外结核患者，证实了NK细胞数量降低可能导致MTB的全身播散，从而导致肺外结核的增加。

此外，虽然陆恩词和朱颖蔚[20]的研究提示肺结核并发糖尿病患者T淋巴细胞亚群低于单纯肺结核，但是本次研究中并未发现肺结核的并发症(本研究中170例患者发生并发症，其中包括123例并发糖尿病)与CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及NK细胞表达具有相关性。

本次研究虽然样本量较大，分析具有很强的客观性，但尚存在一定的局限性，回顾性研究分析指标较多，建立的多元线性回归模型由于变量较多，变量间存在比较复杂的联系和干扰，可能影响分析结果，亟待未来进一步优化研究方案、进行更深入的研究来予以证实。

本次研究运用多元线性回归模型将肺结核患者的临床特征与T淋巴细胞亚群中的CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞进行了大样本的研究，发现肺结核患者的肺部病灶范围及抗酸染色涂片与CD3+T细胞表达有关，肺部病灶范围越大，CD3+T细胞数量越低；抗酸染色涂片阳性程度越高，CD3+T细胞数量越少。患者的年龄、性别、分子生物学检测结果与CD4+T细胞表达有关，0～<20岁年龄段患者CD4+T细胞低于其他年龄段患者，肺结核患者中男性患者CD4+T细胞数低于女性患者；分子生物学检测阳性患者的CD4+T细胞数量高于阴性患者。患者初治/复治和抗酸染色涂片结果与CD8+T细胞表达有关，初治患者CD8+T细胞数量大于复治患者；抗酸染色涂片阳性程度越高，CD8+T细胞数量越高。是否并发肺外结核与NK细胞的表达有关，并发肺外结核患者NK细胞低于未并发肺外结核患者。这些临床特征相关性的免疫差异性表达可能成为未来免疫治疗研究的切入点。

志谢本文统计学分析由上海外国语大学经济管理学院张耿教授指导，在此表示衷心感谢。