马铃薯StERF10基因克隆及重金属胁迫下表达分析

蒙露露，何冠谛，田维军，李丹丹，黄 云，何腾兵,5*

（1.贵州大学农学院，贵阳 550025；2.贵州大学农业生物工程研究院，贵阳 550025；3.贵州大学，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵阳 550025；4.贵州大学生命科学学院，贵阳550025；5.贵州大学新农村发展研究院，贵阳 550025）

植物在生长发育和环境刺激反应中，通过基因表达转录调控产生对环境胁迫的防御机制，基因表达受特定转录因子调控[1]。转录因子通常包括DNA 结合区、转录调控区、二聚位点和核定位域，这些功能域定义转录因子特征、定位和调控作用，转录因子识别并结合到特定顺式-作用元件或与其他蛋白质相互作用，通过其功能域激活或抑制靶基因转录[2]。ERF 转录因子（ERF transcrip⁃tion factor）是重要转录因子，参与抗多种病害、干旱、盐、冻害等条件下调节一系列下游逆境应答基因表达[3-4]，属于AP2/ERF 转录因子超家族，该家族含有1个或2个由约60个氨基酸组成的AP2结构域[5]，根据AP2 结构域数目及其所结合元件不同，AP2/ERF 转录因子家族可分为AP2 亚族、RAV 亚族、ERF 亚族和 Soloist 成 员[6]。 研 究 表明ERF 类转录因子特异性与下游基因启动子区顺式作用元件GCC-box（核心元件AGCCGCC）结合，在各种生物及非生物胁迫中发挥重要作用[7]，已有研究表明过表达AtERF7 基因使拟南芥植株耐旱性降低，过表达At ERF4 基因减弱拟南芥植株耐盐性[8]；过量表达番茄TERF1基因可提高对干旱和高盐耐受能力[9]；在水稻中过表达番茄ERF 基因TSRF1，激活水稻脱落酸（ABA）合成基因SDR 表达，提高转基因水稻对ABA 敏感性，增强水稻渗透和抗旱性[10]；沉默StERF3 可提高马铃薯叶片对侵染性天敌抗性，提高植株对NaCl 胁迫耐受性，并激活防御相关基因（PR1、NPR1 和WRKY1）[11]；由此表明ERF 类转录因子是一个与植物抗逆相关的关键转录因子。

我国是马铃薯生产大国[12]，马铃薯作为世界性粮食和蔬菜兼用作物[13]，虽已从许多植物中克隆鉴定得到ERF 类转录因子，但集中于干旱[14]、低温[15]、高盐[16]、渗透压[17]、ABA 和抗病[18]胁迫处理研究，关于马铃薯中ERF 类转录因子基因在抵抗重金属胁迫方面研究甚少。为此，本研究从“云薯505”中克隆得到StERF10转录因子基因，通过分析相关生物信息学，预测该基因理化性质、蛋白结构等，运用实时荧光定量PCR 技术研究该基因对不同重金属胁迫（Pb2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+）表达情况，以期为研究马铃薯StERF10基因生物学功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

“云薯505”品种由贵州大学新农村发展研究院保存，重金属 Pb2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+为国家标准样品GSB04-1721-2004 单元素标准溶液，重金属溶液配置成浓度为50 mg·L-1母液，采取盆栽试验，栽培于贵州大学新农村发展研究院试验基地，每个处理设置3个重复，选取苗期长势一致盆栽，生长约60 d 后胁迫处理，对植株中部组织取样，液氮速冻后-80 ℃保存备用。RNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒均购于北京宝日医生物有限公司，反转录试剂盒、克隆载体pMD19-T、DNA Marker 2000 Plus均购于TaKaRa 公司，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.2 马铃薯总RNA提取及cDNA合成

使用OMEGA（北京宝日医生物有限公司）RNA提取试剂盒提取马铃薯总RNA，微量核算测定仪NanoDrop（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）测定RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，选取质量好浓度高RNA反转录，参照Fermentas 公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒说明反转录cDNA。

1.3 马铃薯StERF10基因克隆

基于实验室镉胁迫马铃薯转录组数据，通过登录号（LOC102589042）在NCBI载同源序列，采用Primer 5.0软件设计引物，上游引物为TGTGAAAC⁃TATGATGGAAGG，下游引物为TTCGCCTCTGTA⁃ACTCGC，以马铃薯叶片cDNA 为模板PCR 扩增。扩增体系为 50 μL PCR-Grade Water 9 μl，2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL，dNTP（2 mmol·L-1）10 μL，KOD FX Neo（1 U·μL-1）1 μL，cDNA 5 μL，引物各2 μL。反应程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s；55 ℃退火30 s；68 ℃延伸30 s，循环35次；68 ℃终延伸10 min，4 ℃保温。PCR产物回收、纯化后，连接到pMD19-T 载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态，提取质粒后经PCR鉴定正确测序。

1.4 马铃薯StERF10蛋白生物信息学分析

利用DNAMAN 分析蛋白质氨基酸序列；Prot⁃Param（http://web.expasy.org/protparam/）预测蛋白理化性质；利用Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白亲疏水性；利用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽；使用TMMHMM（https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html/）分析跨膜螺旋；使用在线软件（http://psot1.hgc.jp/form.html）亚细胞定位；使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）预测蛋白质二级结构；使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）对蛋白质三级结构同源建模；NCBI Blast 在线工具比对核酸及氨基酸序列同源性；采用DNAMAN7.0 软件作多序列比对；MEGA7软件构建进化树。

1.5 马铃薯StERF10基因表达分析

将1.2中得到cDNA梯度稀释，根据Ct值确定最佳反应浓度。以稀释后最佳反应浓度为模板，根据克隆得到的StERF10 基因序列设计荧光定量引物，上游引物为CGGATGAGGAAGTGGGGTAAATGG，下游引物为TAAGCACGAGCAGCAGCAACAG，以Actin（F: GCTTCCCGATGGTCAAGTCA； R: GGATT CC AGCTGCTTCCATTC）为内参基因，使用Bio-Rad CFX96（美国伯乐公司）PCR 仪定量分析，PCR程序为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，循环40 次，溶解曲线为仪器默认数值，根据所得Cq值，采用2-△△CT方法计算相对表达量[19]。

2 结果与分析

2.1 马铃薯StERF10基因克隆

以马铃薯苗期叶片cDNA为模板，通过设计特异性引物作PCR 扩增，得到长度约为500 bp 亮带（见图1），片段长度与预期一致，PCR产物经切胶回收纯化送至测序，测序得到序列全长494 bp，CDS序列为438 bp，共编码145个氨基酸。

2.2 StERF10基因编码序列分析

对测序得到的cDNA 序列利用DNAMAN 7.0 软件推定StERF10 基因氨基酸序列见图2，并利用ProtParam工具预测其相对分子质量约16.66374，蛋白含量最多为丙氨酸（Ala）和精氨酸（Arg），各占比9.7%，含量最少为半胱氨酸（Cys），仅占0.7%，理论等电点（pI）为9.04，负电荷残基数（Asp+Glu）有21个，正电荷残基数（Arg+Lys）有24个，原子总数2 309，分子式为C722H1139N219O222S7，不稳定指数为45.96（>40 为不稳定蛋白），脂肪系数为56.62，总平均亲水性（GRAVY）为-0.974（<0 为亲水蛋白），表明StERF10 为不稳定亲水蛋白。利用NCBI 在线CD-Searh 工具分析StERF10 蛋白保守结构域，结果表明该蛋白在61～234 氨基酸位点之间含非常保守DNA 结构域，属于AP2/ERF 家族转录因子，通过WoLF PSORT预测亚细胞定位，结果显示定位于质膜可能性为0.450，定位于微粒体可能性为0.300，定位于线粒体和叶绿体囊可能性为均0.100，说明StERF10蛋白主要定位于细胞质。

2.3 StERF10蛋白亲疏水性分析及信号肽预测

利用Protscale 分析StERF10蛋白亲疏水性，结果见图3，横坐标为序列位置，纵坐标为氨基酸标度，标度定义疏水性氨基酸较高打分值（>0值表示疏水性，<0值表示亲水性）。

由图3 可知，标度值<0 区域比>0 密集，因此结合GRAVY 值为负，更进一步预测该蛋白为亲水蛋白。同时，利用在线软件SignalP-5.0 预测蛋白信号肽表明，C-max、Y-max、S-max 位点均为1，C、Y、S 值均为0，SP='NO'，已知当C、Y、S值计算结果均为‘YES’且平均值在0.5 以上时，才可能存在信号肽。说明StERF10蛋白无信号肽，属于非分泌型蛋白。

2.4 StERF10蛋白二级结构和三级结构预测

使用SOPMA 工具预测蛋白二级结构，结果显示该蛋白中77 个氨基酸形成无规则螺旋（Random coil），占 53.10%，48 个 α 螺旋（Alpha helix），占33.10% ； 16 条 延 伸 链（Extended strand）， 占11.03%；4 个氨基酸形成β转角（Beta turn），占2.76%。利用SWISS-MODEL 作三级结构同源建模，如图4所示。

2.5 StERF10蛋白同源性及进化树分析

通过NCBI BlastP 在线检索与StERF10 同源性较高蛋白，利用DNAMAN 软件比对不同物种氨基酸序列（见图5）。

由图5 可知，该基因与同科属物种龙葵（Sola⁃num nigrum）、番茄（S.lycopersicum）、辣椒（Capsi⁃cum annuum）、烟草（Nicotiana tabacum）ERF10序列具有高度相似性，分别为99.31%、91.95%、85.43%、84.21%。因此该基因命名为StERF10。为进一步了解物种间亲缘关系，选取同源性高龙葵（S.nigrum，GenBank： AEM63544.1）、 番 茄（S.lycopersicum，GenBank： NP_001335346.1）、 辣 椒（C.annuum，GenBank：XP_016568791.1）、烟草（N.tabacum，GenBank：XP_019225029.1）、黄花杜鹃（Rhododen⁃dron williamsianum，GenBank：KAE9457173.1）、牵牛（Ipomoea nil，GenBank：XP_019152321.1）、开心果（Pistacia vera，GenBank：XP_031267256.1）、番木瓜（Carica papaya，GenBank：XP_021903611.1）、葡萄（Vitis vinifera，GenBank：XP_019082291.1）、月季（Rosa chinensis，GenBank：XP_024164760.1）、中华猕猴桃（Actinidia chinensisvar.Chinensis，Gen⁃Bank：PSS31445.1）、山茶（Camellia sinensis，Gen⁃Bank：XP_028080420.1）、三叶草（Olea europaeavar.Sylvestris， GenBank： XP_022876127.1）采 用MEGA7.0 软件邻接法（NJ）构建系统进化树（见图6），结果表明StERF10蛋白与番茄ERF蛋白在进化树同一枝上，亲缘关系最近，进一步表明StERF10蛋白属于AP2/ERF亚家族成员。

2.6 重金属胁迫下StERF10基因表达分析

利用实时荧光定量PCR分析StERF10基因在重金属胁迫下马铃薯苗期不同组织中表达情况，发现StERF10 基因均受重金属 Pb2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+诱导，不同时间及不同组织部位其相对表达量存在差异。分析Pb2+处理下StERF10基因表达情况，总体水平来看在根中表达水平最高，叶中次之，茎中表达水平最低，处理后6 h在根中相对表达量达最大值，为0 h 的19.43 倍，处理12 h后在叶中达到最大值，为0 h的3.9倍；分析Ni2+处理下StERF10基因表达情况，在根和叶中表达水平高，茎中相对较低，处理6 h 在根中表达量最大值，为0 h 的21.16 倍，处理12 h 在叶中表达量最大值，为0 h的8.27倍，处理24 h在茎中表达量最大值，为0 h 的9.74 倍；分析Zn2+处理下StERF10基因表达情况，在根中表达量不显著，处理12 h在茎中表达量最大值，为0 h 的2.16 倍，处理24 h在叶中表达量最大值，为0 h的2.1倍；分析Cu2+处理下StERF10 基因表达情况，在根中表达量不显著，处理6 h 在茎中表达量最大值，为对照的4.46倍，处理12 h在叶中表达量最大值，为对照的3.59倍，处理24 h在茎中表达量最大值，为对照的3.02倍；分析Cd2+处理下StERF10基因表达情况，该基因主要在茎中表达，处理12 h 在茎中相对表达量最大，为对照的13.56 倍。从图7 整体分析可知，StERF10 基因对5 种重金属胁迫响应程度不同，StERF10 基因对重金属Ni2+胁迫处理最为敏感，表明StERF10 基因对5 种重金属胁迫响应模式存在差异。

3 讨 论

ERF类转录因子属于（AP2/ERF）家族，在植物界广泛存在，参与控制初级和次级代谢、生长发育过程，以及对环境刺激反应[20-21]。AP2/ERF 转录因子由于其可塑性和该家族个体成员特异性，为基因工程和作物育种提供有价值靶点[22]。尽管已在马铃薯中发现155个AP2/ERF基因[23]，但关于马铃薯中应答重金属胁迫ERF 类基因鉴定和研究较少。本研究以马铃薯云薯505品种为试验材料，利用同源克隆方法从中扩增得到全长StERF10 基因。核酸序列分析表明，该基因全长494 bp，可编码145 个氨基酸，与马铃薯“加湘1 号”编码295 个氨基酸[24]和马铃薯“费乌瑞它”编码243 个氨基酸[25]存在长度差异，说明不同品种间马铃薯蛋白编码区存在氨基酸数目差异；ProtParam 工具预测结果显示，理论等电点（pI）为9.04，负电荷残基数（Asp+Glu）有21个，正电荷残基数（Arg+Lys）有24个，不稳定指数为45.96（>40 为不稳定蛋白），脂肪系数为56.62，总平均亲水性（GRAVY）为-0.974；进一步分析StERF10蛋白亲疏水性和预测信号肽，结果表明StERF10蛋白不含信号肽，为亲水蛋白，与番茄中ERF转录因子研究结果一致[26]，亚细胞定位预测表明，StERF10 基因编码蛋白主要位于细胞质中，通过二级结构及三级结构分析显示该蛋白主要由 48 个α 螺旋（Alpha helix）、16 条延伸链（Ex⁃tended strand）、4 个氨基酸形成β转角（Beta turn）和77 个无规则螺旋（Random coil）组成。基于进化树分析结果表明，StERF10蛋白与番茄ERF蛋白在进化树同一枝上，亲缘关系最近，此结果与矮牵牛PhABCG26 基因亲缘进化结果相似[27]，表明同科属之间蛋白同源性更高，StERF10蛋白进化过程中高度保守。

植物是重金属进入食物链主要途径[28]。金属毒性通过影响植物各种生理过程，导致作物和产品质量下降[29]。本研究通过荧光PCR分别分析5种重金属胁迫下表达模式，结果表明Pb2+处理6 h 后StERF10基因在根中相对表达量达到最大值，为0 h的19.43 倍；Ni2+处理后6 h 在根中表达量最大值，为0 h的21.16倍；Zn2+处理后12 h在茎中表达量最大值，为0 h的2.16倍；Cu2+处理后6 h在茎中表达量最大值，为对照的4.46倍；Cd2+处理后12 h在茎中相对表达量最大值，为对照的13.56倍，表现为上调表达且在长时间处理条件下呈下调趋势[30]。由总体表达量情况分析可知，StERF10 基因对5 种重金属胁迫响应程度不同，StERF10 基因对重金属Ni2+胁迫处理最为敏感，表明StERF10 基因对5 种重金属胁迫响应模式存在差异。以上结果为研究StERF10 基因功能及重金属胁迫机理奠定理论基础。