染色质重建因子BRG1介导Ile调节牛乳腺上皮细胞乳合成分子机理研究

2020-10-13高学军王璐璐

东北农业大学学报 2020年9期

高学军，王哲，祁昊，王璐璐，甄贞

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

牛奶中富含脂肪[1]。通过提高饲养水平，可增加牛奶中蛋白质和脂肪含量，提高牛乳品质。氨基酸通过 mTOR（Mechanistic target of rapamycin）途径激活翻译机制，影响牛乳蛋白基因表达[1-2]。支链氨基酸（Branched chain amino acid，BCAA）调节细胞周期进程、细胞分化、细胞凋亡及蛋白质合成[3]。泌乳期间BCAA 在乳腺中转运较高[4]。Ile 和亮氨酸独立调节牛乳腺组织mTOR 信号途径中S6K1 磷酸化及蛋白质合成[5]。氨基酸作为蛋白质合成底物以外细胞生理信号分子，可通过G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）、氨基酸转运体、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinosi⁃tol 3-kinase，PI3K）和mTOR[6]调节细胞生理活动，mTOR 激活后促进核糖体蛋白S6 激酶1（S6 kinase 1，S6K1）磷酸化。S6K1 磷酸化可增加编码核糖体蛋白如多聚腺苷酸结合蛋白。因此，S6K1 激活导致mRNA翻译过程中蛋白质合成量增多。mTOR激活后促进生脂转录因子固醇调节元件结合蛋白 1c（Sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP-1c）基因表达和成熟，促进细胞中脂肪合成[7]。部分氨基酸可通过调节BMECs 的mTORS6K1 等信号转导途径促进乳蛋白和乳脂肪合成。赖氨酸通过GPRC6A-PI3K信号通路促进脂肪酸诱导的BMECs 乳脂合成[8]。蛋氨酸通过SNAT2-PI3K-mTOR 等信号通路促进乳蛋白和脂肪合成及细胞增殖[9]。有关Ile 调节BMECs 中乳合成作用和分子机理尚待进一步研究。

ATP 依赖性染色质重建因子Brahma-related gene 1（BRG1）是由SMARCA4基因编码的染色质重建蛋白，是具有ATP 酶活性的哺乳动物开关/蔗糖不可发酵（SWItch/Sucrose non-fermentable，SWI/SNF）类染色质重建复合物核心成分。BRG1包括催化ATP 酶结构域，C-末端溴域、AT-挂钩基序和N-末端区域等多个结构域[10]。BRG1通过与转录因子和其他辅助因子相互作用影响基因激活和抑制[11]。在人类结肠癌细胞中，通过抑制PI3K/AKT通路，BRG1基因敲除下调细胞周期蛋白Cyclin D1表达水平[12]。BRG1 等SWI/SNF 成员调节基因表达机制是生命科学领域研究热点之一，有关BRG1调节基因表达分子机理研究尚待深入。

目前BMECs 中BRG1 对乳合成是否具有调节作用，BRG1是否介导氨基酸调节乳合成尚未见报道。本研究拟揭示BRG1 介导Ile 调节BMECs 中乳蛋白和乳脂肪合成作用和分子机理，旨在阐明Ile通过调节染色质重建调节乳合成信号转导机理。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

试剂：DMEM/F12 粉末、Opti-MEM®I（1×）Reduced Serum Medium（31985-070）及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均购自Gibco公司（美国）。Ile粉末（S20042）购自源叶生物。BODIPY 493/503、Lipofectamine®3000 Reagent（L3000001）购自Invitro⁃gen 公司（美国）。TG GPO（Glycerophosphate oxi⁃dase）-POD（peroxidase）Assay kit购自北京普利莱基因技术有限公司。BRG1 一抗（21634-1-AP）购自Proteintech 公司。β-casein（bs-10032R）和SREBP-1c（14088-1-AP）抗体均购自北京博奥森公司。AKT（sc-1618）、p-AKT (Thr308)（sc-135650）、βactin（sc-47778）和cytokeratin 18（sc-51582）均购自Santa Cruz 公司。HRP 标记二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

仪器：CO2细胞培养箱（3 111）购自Thermo 公司（美国）；倒置相差显微镜（DFC280）、激光扫描共聚焦显微镜（TCS SP2）和DLMB-2 正置荧光显微镜均购自Leica 公司（德国）；MiniChemiTM化学发光成像仪购自北京赛智公司。

1.2 材料

奶牛乳腺组织取自健康泌乳期中国荷斯坦奶牛（黑龙江双城屠宰场）。通过组织块培养法利用DMEM/F12培养液培养原代细胞，培养纯化方法参照文献[13]。将纯化后上皮细胞制成细胞爬片，利用上皮细胞分子标志角蛋白18（Cytokeratin，CK18）作鉴定[11]。

1.3 Ile 对BMECs 乳合成调节及其相关信号通路的影响

取纯化后生长状态良好BMECs，待细胞在六孔板中长至30%～40%，更换不含FBS 的Opti-MEM I 培养基中继续培养，分别添加至终浓度为0、0.25、0.5、0.75、1.0 和 1.25 mmol·L-1的 Ile，24 h后作Western blot、甘油三酯检测及脂滴染色。

1.3.1 Western blot检测

适量2×SDS 上样缓冲液使细胞充分裂解，提取细胞内总蛋白。采用Western blot 技术检测β-酪蛋白（β-casein）、SREBP-1c、S6K1、p-S6K1、BRG1 蛋白水平变化。按说明书操作配制SDSPAGE 凝胶。点样后4 ℃条件下作SDS 凝胶电泳，恒压80 V，当溴酚蓝指示剂到达分离胶界面时调节电压为120 V，待电泳结束后湿转，恒压75 V转膜90 min。根据目的条带分子质量长度剪膜。37 ℃恒温摇床封闭2 h；将NC 膜置于含对应一抗稀释液中4 ℃摇床过夜孵育。第2天，使用辣根过氧化酶标记的二抗于37 ℃恒温摇床孵育90 min。以β-actin 为内参，使用Sag Capture 扫描蛋白条带，ImageJ 64 SAAinc读取蛋白灰度值。

1.3.2 甘油三酯检测

制备细胞培养液上清，利用甘油三酯（Triglyc⁃eride，TG）酶法测定试剂盒检测奶牛乳腺上皮细胞分泌到培养液中TG含量。

1.3.3 脂滴染色

1 mL 4%多聚甲醛固定细胞20 min；PBS 洗2～3 遍，每次 10 min，1 μg·mL-1BODIPY 避光室温染色 15 min；PBS 清洗 2～3 次，每次 10 min；1 μg·mL-1DAPI 标记细胞核，37 ℃避光孵育 15 min；PBS 清洗 2～3 次，每次 10 min。在荧光显微镜观察脂滴荧光染色情况，作荧光扫描和定量分析。用ImageJ 64 SAAinc 软件分析每个细胞内脂滴的面积积分光密度（Area-intergrated optical density,AIOD）。

1.4 Ile 介导BRG1 对乳蛋白、乳脂肪及其相关信号调节分子的影响

由上海吉玛公司购买3 组BRG1 干扰片段以及阴性RNA 对照（Negative control，NC），从3 条siR⁃NA 中筛选最有效的一条干扰片段（正义链：5'GCAUUCUUCAGCAUGCCAATT 3'，反义链：5'UUGGCAUGCUGAAGAAUGCTT 3'）用于 BRG1 siR⁃NA 干扰片段转染。分为4 组：空白组、添加Ile组、空白对照同时转NC组和添加Ile同时转干扰片段组。利用Lipo3000 作转染试验，待细胞在六孔板中长至 60%～70%；将混合物A（120 μLOpti-MEM I+5 μLLipo3000 转染试剂）、B（120 μLOpti-MEM I + 5 μL BRG1siRNA）混合后静置5 min；每孔加入1.25mL不含抗生素的Opti-MEM I培养基；静置15 min 后将干扰片段与转染试剂混合物逐滴加入六孔板。24 h收样，作Western blot检测SREBP-1c、S6K1、p-S6K1、BRG1、β-casein 蛋白表达。Western blot检测方法同1.3.1。

1.5 PI3K对乳合成相关调节信号通路的影响

添加PI3K 抑制剂LY294002，分为4 组：正常培养组、添加Ile 组、空白对照同时加LY294002、添加Ile同时加LY294002组。待细胞在六孔板中汇合度为60%时，更换Opti-MEMⅠ培养基饥饿培养细胞 24 h。按照分组添加 Ile（0.75 mmol·L-1）和LY294002（15 μmol·L-1），处理 24 h，收集细胞，制备蛋白样品。检测BRG1、p-S6K1、S6K1、p-AKT、AKT 和SREBP-1c 蛋白水平变化。Western blot操作方法同1.3.1。

1.6 统计分析

采用ImageJ 64 SAAinc对Western blot条带作灰度分析，对荧光染色图片作AIOD 分析。采用SPSS 17.0 软件对多组数据之间作方差分析。数据结果用平均值±标准差（mean±SE）表示，每组至少重复3次。不同肩标小写字母表示数据彼此差异显著（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 Ile对BMECs乳合成的调节

不同浓度 Ile（0、 0.25、 0.5、 0.75、 1.0 和1.25 mmol·L-1）处理BMECs 24 h后，Western blot 分析显示，随Ile浓度增加，细胞内β-casein（见图1A和1B）蛋白水升高，并在0.75 mmol·L-1处达到峰值，随后蛋白水平下降。Ile 处理显著增加培养基中TG 含量（见图1C）并促进细胞中脂滴积累（见图1D和1E），在0.75 mmol·L-1处作用最显著，随后下降。以上数据表明Ile 以剂量依赖方式刺激BMECs乳蛋白、乳脂合成。

2.2 Ile对BMECs乳合成相关信号分子途径的影响

不同浓度 Ile 处理细胞 24 h 后，Western blot 分析进一步确定Ile处理增加S6K1磷酸化并显著上调SREBP-1c蛋白质水平，且在0.75 mmol·L-1Ile处理出现最大增加（见图2）。此外，结果显示在0.75 mmol·L-1Ile处理组，BRG1表达同样显著提高，灰度扫描分析以上蛋白表达水平，通过3个平行试验获得数据表明Ile上调乳蛋白、乳脂合成相关信号分子导致乳合成增加，同时Ile正向调节BRG1表达。

2.3 干扰BRG1 对乳蛋白和乳脂肪合成相关信号分子的影响

细胞转染BRG1siRNA 48 h 后，用Western blot筛选最佳干扰片段，结果见图3A 和3B。由图可知，与空白对照组和阴性对照组相比，BRG1siR⁃NA-3 组BRG1 表达量显著降低，说明BRG1siR⁃NA-3可用于后续基因敲低试验。

细胞用Ile（0.75 mmol·L-1）处理并同时转染 si-BRG1， Western blot 检测各组 S6K1、 p-S6K1、SREBP-1c、BRG1、 β-casein 和 β-actin 蛋白表达，结果见图4。Ile 处理组较空白对照组β-ca⁃sein、p-S6K1、SREBP-1c、BRG1蛋白相对水平表达显著增加，BRG1 敲低组p-S6K1、SREBP-1c 表达量均显著降低，提示BRG1 敲低完全阻断Ile 对S6K1磷酸化和SREBP-1c蛋白表达有促进作用。

2.4 PI3K 对BMECs 乳合成调节相关信号通路的影响

Western blot 分析显示，经 PI3K 抑制剂LY294002（15 μmol·L-1）处理的细胞AKT 磷酸化几乎消失（见图5）。LY294002可抑制Ile刺激S6K1磷酸化、SREBP-1c和BRG1蛋白表达（见图5）。表明PI3K 介导Ile 调节BRG1 在乳合成调节过程中发挥作用。

3 讨论

细胞中BRG1 通常作为中心酶亚单位存在于SWI/SNF 染色质重建复合体，在转录调控、DNA复制、修复和重组中发挥作用。支链氨基酸促进乳腺上皮细胞蛋白质合成，与mTOR激活mRNA翻译启动有关。本试验以Ile 作为调节因子，探究BRG1 介导Ile 在乳腺上皮细胞中乳合成分子机理。结果显示，Ile 通过S6K1 与SREBP-1c 相关信号途径调控乳蛋白、乳脂合成。BRG1介导Ile正向调控S6K1 磷酸化和SREBP-1c 表达。抑制PI3K 途径后BRG1 蛋白水平显著下降，说明在乳合成过程中PI3K 介导Ile 调节BRG1 发挥作用。试验结果表明BRG1 可介导 Ile 通过 S6K1 与 SREBP-1c 信号通路调节BMECs中乳蛋白、乳脂肪合成。

当 Ile 浓度低于 0.75 mmol·L-1时，Ile 剂量依赖性促进BMECs 乳蛋白质合成、TG 分泌和脂滴形成。另外，Ile 增加p-S6K1 和SREBP-1c 蛋白水平表达，S6K1 和SREBP-1c 为乳蛋白和脂肪合成相关信号通路关键成份。补充Ile 可改善泌乳母猪乳蛋白合成[14]。研究表明过量Ile 对大鼠空肠形态和抗菌肽表达具有显著影响[15]。氨基酸适量范围内可改善细胞环境营养水平，过量可能造成氨基酸之间拮抗与不平衡，甚至产生毒性。综合本研究结果，表明Ile 以剂量依赖方式调节BMECs 中乳蛋白和乳脂肪合成及S6K1磷酸化和SREBP-1c表达。

添加Ile 同时抑制BRG1，Western blot 结果显示p-S6K1 与SREBP-1c 蛋白表达量与对照组相比降低。BRG1作为染色质重建因子可通过调节基因转录发挥作用。在乳腺癌细胞中，BRG1上调负责脂肪酸和脂质生物合成酶表达[16]。推测BRG1 可介导Ile 促进S6K1 与SREBP-1c 表达。但目前未见BRG1在奶牛乳腺上皮细胞中调控基因转录表达具体研究。为了解Ile 调节BRG1 表达分子机制，利用LY294002抑制PI3K信号通路。结果表明，Ile调节S6K1、SREBP-1c 信号通路以及BRG1 表达需PI3K激活。在神经母瘤细胞中，BRG1缺失影响与细胞生长、增殖相关的基因，包括PI3K/AKT 通路组成部分[17]。研究表明BRG1 高表达哮喘小鼠的PI3K/AKT/mTOR 通路受抑制，而支气管上皮细胞BRG1敲除则促进PI3K/AKT/mTOR 通路表达[18]，综合本试验结果，提示BRG1也影响PI3K信号途径。

目前BRG1 通过何种调节方式影响S6K1 和SREBP-1c 信号通路尚不清楚。BRG1 除催化ATPase结构域，N端和C末端均可能作为潜在蛋白质相互作用模块区域，这些区域可识别修饰的组蛋白，将BRG1 染色质重建活性聚集于基因组靶上。Trotter 等研究表明，BRG1 通过改变染色质结构，特别是通过影响关键组蛋白修饰调节转录[19]。因此，推测BRG1 介导Ile 调节S6K1 及SREBP-1c相关信号通路可能通过组蛋白修饰过程影响S6K1和SREBP-1c的mRNA表达，影响S6K1与SREBP-1c信号通路强弱。