Stathmin、P16、P63、Ki-67在宫颈上皮内瘤变中的表达及意义

张新东　赵甜甜　马静

[摘要] 目的 探讨Stathmin、P16、P63、Ki-67在子宫颈鳞状上皮内瘤变（CIN）中的表达及意义。 方法 收集2017年6月～2018年6月间在我院宫颈活检及利普刀锥切标本396例，其中慢性宫颈炎标本74例作为对照组，CINⅠ级標本113例、CINⅡ级标本122例、CINⅢ级标本87例作为观察组。采用免疫组化（IHC）检测Stathmin、P16、P63、Ki-67的表达情况。 结果 Stathmin蛋白在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ的表达分别为5.41%（4/74）、15.93%（18/113）、38.53%（47/122）、88.51%（77/87），其中观察组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。P16蛋白在对照组和观察组的表达分别为12.16%（9/74）、85.84%（97/113）、100.00%（122/122）、100.00%（87/87），观察组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。P63蛋白在对照组和观察组的表达分别为6.76%（5/74）、66.37%（75/113）、97.54%（119/122）、100.00%（87/87），观察组分别与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01），Ki-67在对照组和观察组的表达分别为24.32%（18/74）、75.22%（85/113）、100.00%（122/122）、100.00%（87/87），观察组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 联合检测Stathmin、P16、P63、Ki-67有助于鉴别宫颈的良性病变和宫颈上皮内瘤变，并可区分宫颈上皮内瘤变的低度病变和高度病变，以准确指导临床治疗。

[关键词] Stathmin;P16;P63;Ki-67;宫颈鳞状上皮内瘤变

[中图分类号] R737.3          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）23-0140-05

Expression and significance of Stathmin， P16， P63， Ki-67 in cervical intraepithelial neoplasia

ZHANG Xindong   ZHAO Tiantian   MA Jing

Department of Pathology， Tengzhou Central People's Hospital in Shandong Province， Tengzhou   277500， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of Stathmin， P16， P63， Ki-67 in cervical squamous intraepithelial neoplasia（CIN）.  Methods 396 cases of cervical biopsy and lip knife cone cutting specimens were collected in our hospital from June 2017 to June 2018， including 74 cases of chronic cervicitis specimens as a control group， 113 cases of CIN I grade specimens， 122 cases of CIN II grade specimens， 87 cases of CIN Ⅲ specimens were used as an observation group. Immunohistochemistry（IHC） was used to detect the expression of Stathmin， P16， P63 and Ki-67. Results The expression of Stathmin protein in chronic cervicitis， CINⅠ， CINⅡ， and CINⅢ was 5.41%（4/74）， 15.93%（18/113）， 38.53%（47/122）， and 88.51%（77/87）， and there were statistically significant differences between the observation group and control group（P<0.01）. There were statistically significant differences in the expression of P16 protein between the observation group[12.16%（9/74）] and the observation group[85.84%（97/113）， 100.00%（122/122）， and 100.00%（87/87）]（P<0.01）. There were statistically significant differences in the expression of P63 protein between the control group [6.76%（5/74）] and the observation group [66.37%（75/113）， 97.54%（119/122）， and 100.00%（87/87）， respectively]（P<0.01）. The expression of Ki-67 was 24.32%（18/74） in the control group， 75.22%（85/113）， 100.00%（122/122）， and 100.00%（87/87） in the observation group， and the difference between the two groups was statistically significant（P<0.01）. Conclusion The joint detection of Stathmin， P16， P63 and Ki-67 is helpful to identify benign cervical lesions and cervical intraepithelial neoplasia， and can distinguish between low-grade and high-grade cervical intraepithelial neoplasia to accurately guide clinical treatment.

[Key words] Stathmin; P16; P63; Ki-67; Cervical squamous intraepithelial neoplasia

子宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，是威胁女性健康和生命的主要恶性肿瘤之一，近年来发病率有所增加，且有年轻化趋势。与宫颈浸润癌密切相关的癌前病变的是宫颈鳞状上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN），是与子宫颈癌有紧密联系的一组癌前病变的统称[1]，它包括了宫颈低级别鳞状上皮内瘤变（Low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和宫颈高级别鳞状上皮内瘤变（High-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），LSIL包括湿疣及CINⅠ，HSIL包括了CINⅡ和CINⅢ。LSIL大部分可自然消退，仅少数继续可进展为HSIL和浸润癌，而大部分HSIL具有癌变潜能，并且两者的治疗方案也完全不同，因此准确区分LSIL和HSIL具有至关重要的临床意义。当宫颈上皮病变组织出现如反应性鳞状上皮增生、基底细胞增生、不成熟鳞状上皮化生、移行上皮化生和萎缩等情况时，病理医师有可能受自身主观因素的影响，在病理诊断结果上会有很大程度上的偏差，这时会致临床漏诊、误诊造成错误治疗。因此，为了提高CIN诊断的准确性，使用有效的生物学标记物为组织病理学诊断提供客观依据就显得尤为重要[2-5]。本研究采用免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）方法联合检测Stathmin、P16、P63、Ki-67在宫颈鳞状上皮病变中的表达，探讨其差异性及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集滕州市中心人民医院病理科2017年6月～2018年6月间宫颈活检及锥切标本396例，其中慢性宫颈炎标本74例作为对照组，年龄21～78岁，平均40.5岁。观察组包括CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级，总共322例。CINⅠ级标本113例，年龄21～69岁，平均年龄38.1岁;CINⅡ级标本122例，年龄24～70岁，平均39.7岁;CINⅢ级标本87例，年龄25～66岁，平均44.1岁。所有的病理切片均由两名高年資病理医师共同阅片确诊。各组年龄比较均无明显统计学差异（P>0.05），具有可比性。本研究所涉及的相关病理检测符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的要求。

1.2 方法

396例宫颈活检及锥切标本均经10%中性甲醛固定，全自动脱水机（Leica ASP300S）脱水，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，常规HE染色，光镜观察。采用全自动免疫组化染色机（LEICA BOND-MAX）进行免疫组化检测Stathmin、P16、P63、Ki-67的表达，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗做阴性对照染色。

1.3 试剂

兔抗人Stathmin单克隆抗体（克隆号：SP49）、鼠抗人P16单克隆抗体（克隆号：MX007）、鼠抗人P63单克隆抗体（克隆号：MX008）、鼠抗人Ki-67单克隆抗体（克隆号：MX006），以上试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.4 免疫组化结果判定[6]

阳性结果判定标准：用光学显微镜观察显色反应，在高倍镜下（×400）对每一张切片随机选择具有代表性的5个视野， 并且每个视野计数100个细胞，总共计数500个细胞，然后计算每张切片阳性细胞数所占的百分比。（1）Stathmin以细胞质内见到棕黄色颗粒为阳性。（2）P16以细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。（3）P63以细胞核内出现棕黄色颗粒阳性。（4）Ki-67以细胞核内出现棕黄色颗粒阳性。（5）按照阳性细胞百分比的多少分4级：无阳性细胞（-）为0～10%，弱阳性（+）为10%～25%，中度阳性（++），25%50%，>50%强阳性（+++）。

1.5 统计学方法

应用GraphPad 6.0软件对所有数据作统计学分析，阳性率值计算为各组阳性表达例数比总例数的值，计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Stathmin、P16、P63、Ki-67在各组子宫颈病变标本中的表达情况

统计结果所示，Stathmin、P16、P63、Ki-67蛋白在慢性宫颈炎、CINⅠ级、CINⅡ级和CINⅢ级组织中的阳性率表达是逐渐增高的，并且三组观察组的阳性率都高于对照组。见表1。

2.2 Stathmin蛋白表达在各组间比较

Stathmin的表达定位在细胞质（封三图9）;结果显示Stathmin在慢性宫颈炎组的阳性表达率明显低于三组观察组，差异有统计学意义（P<0.05）;CINⅠ级组阳性表达率明显低于CINⅡ级组和CINⅢ级组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 P16蛋白表达在各组间比较

P16蛋白的表达定位在细胞核或细胞质（封三图10）;结果显示P16在慢性宫颈炎组的阳性表达率明显低于三组观察组，差异有统计学意义;CINⅠ级组阳性表达率明显低于CINⅡ级组和CINⅢ级组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 P63蛋白表达在各组间比较

P63蛋白的表达定位在细胞核（封三图11）;结果显示P63在慢性宫颈炎组的阳性表达率明显低于三组观察组，差异有统计学意义（P<0.05）;CINⅠ级组阳性表达率明显低于CINⅡ级组和CINⅢ级组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.5 Ki-67蛋白表达在各组间比较

Ki-67蛋白的表达定位在细胞核（封三图12）;结果显示Ki-67在慢性宫颈炎组的阳性表达率明显低于三组观察组，结果有统计学意义;CINⅠ级组阳性表达率明显低于CINⅡ级组和CINⅢ级组，差异结果有统计学意义。见表5。

3 讨论

CIN是宫颈癌发生的黄金阶段，在筛查宫颈上皮病变时，如何利用有效的客观指标来评价各级CIN也是病理医师的诊断难点。CIN分级不同，它的治疗和预后也有很大的差异，因此为了明确鉴别CIN级别需借助免疫组织化学标记物来辅助诊断。病理日常工作中常用的抗体是P16、Ki-67，但这两种抗体标记对CIN的诊断仍存在一定的偏差，不可避免出现漏诊和误诊。而本研究通过联合检测Stathmin、P16、P63、Ki-67有助于明确CIN级别和提高诊断准确率，最大程度减少了漏诊和误诊。

Stathmin是一种相对分子量为19 KD的蛋白质，广泛存在于细胞质中。它是一种微管相关蛋白（Microtubule associated protein，MAPs），由于其作用可以促进微管的解聚，参与细胞生长和细胞周期的调节，引起细胞生物学行为变化，具有癌蛋白的功能[7]，在恶性肿瘤发生、发展及表型决定上的重要作用及意义，可在多种肿瘤中呈高表达。有研究表明，Stathmin在所有的子宫颈癌和CINⅢ级都是过表达，而在低级别病变中不表达或部分表达。Brooke等研究证实Stathmin在宫颈上皮内瘤变高表达，且与病变级别相关[8]。本研究中发现Stathmin蛋白在LSIL组和HSIL组差异有统计学意义，CIN组织中Stathmin与P16蛋白表达有正相关性，与Howiitt BE等[9]的报道一致。所以Stathmin协同P16检测可提高宫颈上皮内病变的分级准确率。

P16是一种重要的抑癌基因，它位于人类染色体9P21，它参与了细胞周期的调控。P16蛋白通过抑制细胞周期依赖性蛋白激酶4（Cdk4）的活性，阻止细胞进入S期。它一旦失活会导致恶性增殖，在判断良性宫颈病变、CIN中有十分重要的临床意义[10]。国内外研究表明，P16是检测子宫颈癌前病变的一个有效指标，许多实验也支持P16在宫颈HSIL中的诊断价值[11，12]，但P16一般与具有人乳头瘤病毒（HPV）感染所致的CIN病变有更为密切的关系，用P16来代替高危HPV检测的敏感性和特异性达到80%以上[13-15]。P16的表達随着宫颈病变的级别上升而表达强度增强，是宫颈上皮内瘤变病理诊断的很好的补充[16]。本研究结果显示，CIN组中P16阳性表达率明显高于正常对照组，P16在宫颈CINⅡ及CINⅢ组阳性表达率明显高于宫颈CINⅠ组，表明P16可以有效提高对早期宫颈病变进展的预测效果，从而可以对这部分患者进行密切监测及早期干预治疗。

P63是近年来发现的P53基因家族新成员，定位于染色体3q27～3q28，是一种核蛋白，与抑癌基因P53具有同源性的基因编码，参与肿瘤的发生、发展以及细胞凋亡过程。陈玮等[17]研究证实P63在正常子宫颈鳞状上皮呈阴性表达，鳞状上皮增生可呈阳性表达，P63阳性表达强度随CIN级别增高而显著升高。本研究结果显示，P63在CIN表达阳性率高于正常组织，提示P63随着宫颈病变的进展其阳性表达率显著上升，与大多数文献报道相同[18]。

Ki-67是目前较为肯定的核增殖标志物，存在于细胞周期中除G0期以外的所有阶段。Ki-67蛋白在鉴别慢性宫颈炎、高低级别CIN及宫颈癌中有较大的意义，研究认为Ki-67蛋白与宫颈病变的严重程度相关，可作为鉴别诊断的指标[19]。徐涛等[20]研究结果发现，在CIN组中阳性率随CIN级别升高而升高，在宫颈癌组织中的表达最强。Lorenzato M等[21]研究显示子宫颈上皮的上2/3发现Ki-67阳性表达可作为鉴别LSIL、HSIL的标志。本研究显示，Ki-67阳性表达在慢性宫颈炎及CIN中差异显著，且阳性程度随CIN级别的升高而升高，提示宫颈上皮病变的过程是细胞增殖逐渐活跃的过程，Ki-67阳性表达程度对CIN分级的诊断有提示作用。但由于Ki-67存在于增殖的细胞中，部分炎性疾病和CINⅠ级宫颈组织中的也可见Ki-67阳性表达，因此在鉴别子宫颈上皮内瘤变时最好与其它指标联合，国内经常把P16、Ki-67联合使用，作为判断子宫颈良性病变与CIN的客观指标。崔凯等[22]研究显示，检测p16蛋白及Ki-67抗原的表达对CIN的分级诊断具有较高的价值。

综上所述，CIN是多基因、多因素共同作用的结果，准确、客观地诊断CIN及其分级对临床进一步治疗和预后评价是非常重要的。尽管区分LSIL和HSIL非常重要，但组织形态学上两者是连续的病变，并没有一个截然的分界线，本研究结果显示，联合检测Stathmin、P16、P63和Ki-67，可以区分HSIL与LSIL和良性反应性改变，在一定程度上尽可能的避免不同病理医师对CIN进行诊断时出现可重复性差的问题，使CIN分级更加精确，使诊断更加客观，为临床治疗提供确实有效的病理诊断依据，减少了误诊造成的错误治疗，有效减轻了患者的精神及经济负担，对有效预防子宫颈癌的发生和早期治疗具有重要意义。

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（收稿日期：2020-04-08）