三种快速实验室检测技术在儿童结核性脑膜炎早期诊断中的价值

樊丽超　朱雅娟　曹宏丽

[摘要] 目的 評价三种快速实验室检测技术对儿童结核性脑膜炎的早期诊断价值。 方法 收集沈阳市胸科医院2017年6月～2019年12月收治的疑诊儿童结核性脑膜炎病例52例，分别进行血T-SPOT.TB、脑脊液LAMP和脑脊液Xpert MTB/RIF检测。结果采用SPSS18.0软件进行统计分析，计算三种检测方法在诊断结核性脑膜炎的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率。 结果 在52例患者中，血T-SPOT.TB诊断结核性脑膜炎的敏感度为93.75%，特异度8.33%，阳性预测值31.25%，阴性预测值75.00%，一致率34.62%。脑脊液LAMP诊断结核性脑膜炎的敏感度为81.25%，特异度75.00%，阳性预测值59.09%，阴性预测值90.00%，一致率76.92%。脑脊液Xpert MTB/RIF诊断结核性脑膜炎的敏感度为87.50%，特异度88.89%，阳性预测值77.78%，阴性预测值94.12%，一致率88.46%。 结论 血T-Spot、脑脊液LAMP和脑脊液Xpert MTB/RIF检测对儿童结核性脑膜炎的早期诊断具有一定的价值，值得临床推广。

[关键词] 结核性脑膜炎;早期诊断;结核感染T淋巴细胞斑点试验;环介导等温扩增;Xpert MTB/RIF

[中图分类号] R52.9.3          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）23-0118-04

The value of three rapid laboratory testing techniques in the early diagnosis of pediatric tuberculous meningitis

FAN Lichao   ZHU Yajuan   CAO Hongli

Department of Tuberculosis， Shenyang Tenth People's Hospital， Shenyang Chest Hospital， Shenyang   110044， China

[Abstract] Objective To evaluate the value of three rapid laboratory testing techniques for early diagnosis of pediatric tuberculous meningitis. Methods 52 cases of suspected pediatric tuberculous meningitis who were admitted to Shenyang Chest Hospital from June 2017 to December 2019 were collected. Blood T-SPOT.TB， cerebrospinal fluid LAMP and cerebrospinal fluid Xpert MTB/RIF were tested respectively. The results were statistically analyzed using SPSS18.0 software. The sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value， and agreement rate of the three detection methods in the diagnosis of tuberculous meningitis were calculated. Results In 52 patients， the sensitivity of blood T-SPOT.TB for diagnosis of tuberculous meningitis was 93.75%， specificity was 8.33%， positive predictive value was 31.25%， negative predictive value was 75.00%， and agreement rate was 34.62%. The sensitivity of cerebrospinal fluid LAMP in the diagnosis of tuberculous meningitis was 81.25%， specificity was 75.00%， positive predictive value was 59.09%， negative predictive value was 90.00%， and agreement rate was 76.92%. The sensitivity of cerebrospinal fluid Xpert MTB/RIF for the diagnosis of tuberculous meningitis was 87.50%， specificity was 88.89%， positive predictive value was 77.78%， negative predictive value was 94.12%， and agreement rate was 88.46%. Conclusion The detection of blood T-Spot， cerebrospinal fluid LAMP and cerebrospinal fluid Xpert MTB/RIF has a certain value for the early diagnosis of pediatric tuberculous meningitis， which is worthy of clinical promotion.

[Key words] Tuberculous meningitis; Early diagnosis; T-lymphocyte spot test for tuberculosis infection; Loop-mediated isothermal amplification; Xpert MTB/RIF

性脑膜炎（Tuberculous menigitis，TBM）是脑膜的非化脓性炎症，一般为结核分枝杆菌经血液或直接侵入蛛网膜下间隙引起，该病发病急缓不定，病程长，致残率和致死率高，是结核病中最严重的类型[1]。儿童因中枢神经系统发育不成熟，细胞免疫功能低下，是TBM的易感人群，我们在临床工作中发现，儿童患者尤其是低龄患儿很难正确描述病情，配合完成结核相关检查，导致误诊误治的几率明显增高，因此有效的早期诊断方法对改善儿童TBM的预后至关重要[2]。

传统的TBM诊断金标准为脑脊液抗酸染色阳性或脑脊液结核菌培养阳性，但抗酸染色阳性率极低，结核菌培养耗时长，对TBM的早期诊断价值有限，因此临床上急需新的诊断技术。结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是以T细胞免疫应答作为基础的γ-干扰素释放试验，通过检测结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10特异性效应T细胞，从而用于结核杆菌的检测和结核病的辅助诊断的新技术，T-SPOT的刺激原ESAT-6及CFP-10抗原基因严格限制于结核分枝杆菌复合群及4种非结核分枝杆菌，不存在于卡介苗中，从而避免了传统结核杆菌皮试中存在的BCG交叉抗原反应，保证了T-SPOT试验的特异度，目前已广泛应用于临床[3-4]。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是可以检测结核分枝杆菌的一种新型的恒温核酸扩增技术，具有特异性高、时间短、操作简单等优点，适用于全国各级结核病实验室[5]。Xpert MTB/RIF是美国Cepheid公司开发，以半套式实时定量聚合酶链反应扩增技术为基礎，能自动抽提DNA并扩增rpoB基因的诊断平台，目前在肺结核的诊断中敏感度和特异度较高，并且可用于脑脊液的检测[6]，我们对沈阳市胸科医院收治的52例儿童TBM患者进行了MGIT960培养、血T-SPOT.TB、脑脊液LAMP和脑脊液Xpert MTB/RIF检测，评价其对儿童TBM的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取沈阳市胸科医院2017年6月～2019年12月临床诊断为TBM的病例52例，年龄1～17岁，其中男29例，女23例，参照第8版《实用儿科学》，入组病例的诊断标准为：（1）有头痛、恶心呕吐、发热等临床症状。（2）查体有颈强直，脑膜刺激征阳性等表现。（3）腰穿提示高颅压，脑脊液化验细胞数升高，以淋巴细胞为主，葡萄糖和氯降低，蛋白升高。（4）头CT或MRI提示为渗出改变、脑积水、脑膜强化、脑梗死或脑实质内结核球改变、胸部X线或CT有原发肺结核特征。（5）符合以下各项之一者：最近体重明显减轻，有与痰涂片阳性的肺结核家属密切接触史，或合并其他颅外结核病，PPD强阳性，结核抗体阳性，脑脊液涂片查抗酸杆菌阳性，或PCR TB-DNA阳性。（6）除外其他神经系统疾病[7]。

1.2 方法

1.2.1 脑脊液和血液的采集和检测  所有患者均取入院后第一次腰穿脑脊液3 mL，血液标本均为入院后次日晨起空腹静脉血，标本采集前均取得患者监护人同意，签署用于本次临床试验采取标本的知情同意书。所有实验部分均由沈阳市胸科医院结核病实验室完成。标本采集后送检脑脊液MGIT960培养、血T-SPOT.TB、脑脊液LAMP和脑脊液Xpert MTB/RIF检测，操作严格按照《结核病实验室诊断检验规程》和试剂说明书进行操作[8]。

1.2.2 MGIT960培养  收集患者入院后第一次腰穿脑脊液，经4%NaOH溶液处理，取0.1 mL接种于酸性罗氏培养基，置于37℃恒温培养箱培养，MGIT960液体培养系统由美国BD公司生产，将脑脊液标本按照BACTEClM MGIT生产规范（MGITlM Procedure Manual）要求进行培养[9]。

1.2.3 T-SOPT.TB检测  所有患者均取入院后次日晨起静脉血4 mL于抗凝管中，混匀后装入“T”、“N”、“P”三种培养管中，再次混匀5次后于37℃培养约24 h，培养后3000～5000 r/min离心10 min，离心后取上清液加入样品孔，混匀封板37℃ 60 min后加酶标试剂50 μL。混匀封板37℃放置60 min，洗板5遍，加显色剂A/B各50 μL，37℃避光显色15 min，加终止液震荡均匀，10 min后450 nm检测[10]。

1.2.4 LAMP检测  将收集的患者脑脊液吸入吸附剂试管中混匀裂解（90℃，5 min）。将吸附管装到样本处理管上，摇晃5～10次后提取核酸，加上滴注盖，轻压样本处理管将样本滴入反应管中。充分混合后进行LAMP反应，于67℃，反应40 min，然后放入恒温荧光核酸扩增LF-160的荧光目视检测单元，通过紫外线激发荧光观察反应结果[11]。

1.2.5 Xpert MTB/RIF  向1 mL脑脊液中加入1 mL样本处理充分混匀，放置15 min并间断摇晃，然后用无菌吸管将2 mL液体移入塑料试剂盒中，后者插入Xpert MTB/RIF检测平台中，输入样品相关信息后运行仪器会自动进行样品的过滤和洗涤，超声溶菌释放出DNA后与PCR反应试剂混合，半巢式实时扩增并检测荧光信号，根据循环阈值的高（CT<16）、中（16≤CT≤22）、低（22

1.3 统计学处理

采用SPSS18.0软件，计算脑脊液MGIT960培养、血T-SPOT.TB、脑脊液LAMP和脑脊液Xpert MTB/RIF诊断结核性脑膜炎的阳性率、敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值和一致率。

2 结果

2.1 三种检测方法的检出情况比较

将52例患者的标本进行脑脊液MGIT960培养、血T-SPOT.TB、脑脊液LAMP和脑脊液Xpert MTB/RIF检测，脑脊液MGIT960培养阳性16例（30.77%），血T-Spot阳性48例（92.31%），脑脊液LAMP阳性22例（42.31%），GeneXpert阳性18例（34.62%）。见表1～3。

2.2 三种检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率

以MGIT960液体培养检测结果为标准判断血T-SPOT.TB诊断TBM的敏感度为93.75%，特异度8.33%，阳性预测值31.25%，阴性预测值75.00%，一致率34.62%。脑脊液LAMP诊断TBM的敏感度为81.25%，特异度75.00%，阳性预测值59.09%，阴性预测值90.00%，一致率76.92%。脑脊液Xpert MTB/RIF诊断TBM的敏感度为87.50%，特异度88.89%，阳性预测值77.78%，阴性预测值94.12%，一致率88.46%（表4）。

3 讨论

结核病是当今世界上危害儿童健康的主要传染病之一，世界卫生组织（WHO）报告的数据显示，全球每年有约104万例的新发儿童结核病，占全球新发结核病的6.9%[13]。儿童因中枢神经系统和免疫系统发育不成熟，在感染结核菌后，极易发展为中枢神经系统结核，部分儿童TBM的临床症状不典型，病情进展迅速，造成较高的致残率和死亡率，因此儿童TBM的早期诊断和尽早治疗至关重要[14]。目前随着结核病实验室诊断技术的发展，涌现出很多方法用于结核分枝杆菌的快速诊断，本研究系统评价了血T-SPOT.TB、脑脊液LAMP和脑脊液Xpert MTB/RIF检测在以脑脊液MGIT960培养为标准时诊断儿童结脑的价值。

本研究中血T-SPOT.TB的阳性率92.31%，敏感度为93.75%，特异度8.33%，阳性预测值31.25%，阴性预测值75.00%，一致率34.62%。说明T-SPOT.TB可以明显提高结脑的检出率，但需注意假阴性的可能，T-SPOT.TB阳性时需结合其他临床资料进行综合判断，而T-SPOT.TB阴性对于排除诊断意义更大。既往儿童结核病的诊断主要依靠结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST），但TST受机体免疫功能、结核菌素交叉抗原反应和观察者主观因素的影响较大，导致敏感度和特异度较差，T-SPOT.TB是通过有效释放IFN-γ的效应T淋巴细胞来对结核分枝杆菌感染情况做出判断的技术，由于结核菌RD1基因在卡介苗和绝大多数非结核分枝杆菌的基因组中缺失，因而不受卡介苗及环境分枝杆菌的影响，也不受免疫功能状态的影响，诊断结核感染敏感性和特异性更高[15]。徐丽丹等[16]研究发现T-SPOT.TB对处于免疫系统发育不完善的婴幼儿或应用免疫抑制药物的患儿仍有较理想的敏感性。因此T-SPOT.TB可以作为儿童TBM的辅助诊断工具，可以有效减少儿童TBM的误诊率和漏诊率。

本研究中脑脊液LAMP的阳性率42.31%，明显高于脑脊液涂片镜检和培养，同时本研究以MGIT960培养检测结果为标准时LAMP敏感度为81.25%，特异度75.00%，阳性预测值59.09%，阴性预测值90.00%，一致率76.92%。体现了LAMP简单、便捷、敏感度高、特异度高的优势。本研究中有9例MGIT960液体培养阴性而LAMP阳性的病例，考虑可能的原因为：脑脊液载菌量低，送检标本的载菌量远低于MGIT960液体培养的检出限，而LAMP对结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的检出限达到了10 CFU/mL，远高于MGIT960液体培养的检出限，因此说明在MGIT960液体培养阴性的标本中不一定没有结核菌[17]。孙雯雯等[18]报道LAMP存在假阳性可能，考虑的原因为：临床标本在扩增过程中被气溶膠污染，造成了假阳性。培养法只能对活菌进行培养，而LAMP对没有活性的菌株也可以进行扩增，从而造成LAMP检测阳性而培养法为阴性的情况。

Xpert MTB/RIF检测痰标本用于肺结核的诊断已得到国际上的认可，2014年WHO推荐在儿童疑似结核病中优先采用Xpert MTB/RIF实验进行初筛，目前文献报道Xpert MTB/RIF对肺结核诊断总灵敏度为90.4%，总特异性为98.4%，但其对脑脊液、胸腹腔积液、关节液和心包积液等不同标本的敏感度有较高的异质性[19]。在本研究中脑脊液Xpert MTB/RIF的敏感度为87.50%，特异度88.89%，阳性预测值77.78%，阴性预测值94.12%，一致率88.46%。体现了其对儿童早期TBM的诊断优势，并可同时提供利福平的耐药情况，为耐药结脑的治疗提供依据，因此可推荐在有条件的医疗机构广泛应用。

在本研究中T-SPOT.TB的敏感度最高，可以提高儿童结脑的诊断率，且不受卡介苗和患者免疫系统发育不完善的影响，但需要注意假阴性的影响，在儿童TBM患者中的排除诊断意义更大。LAMP设备简单，价格低廉，对操作人员技术要求较低，相对于Xpert MTB/RIF更适合在基层推广。Xpert MTB/RIF的敏感度和特异度优于MGIT960培养，且能提供利福平耐药情况，但主要的局限性在于Xpert MTB/RIF的技术设备价格较高，操作环境需要维持一定的温度和湿度，甚至需要空调来调节操作和存储温度，因此一定程度上限制了Xpert MTB/RIF推广应用。

上述三种快速实验室检测技术对儿童TBM的诊断具有较高价值，但本研究病例数较少，存在一定的偏倚，今后仍需扩大样本量以进行更深入的研究。

[参考文献]

[1] 唐神结，高文.临床结核病学[M].北京：人民卫生出版社，2011：402-403.

[2] 祁雪，申阿东，孙琳，等.两种检测技术在不同危险因素等级儿童中筛查潜伏性结核感染的结果分析[J].中国防痨杂志，2018，40（9）：924-931.

[3] Abubakar I，Drobniewski F，Southern J，et al. Prognostic value of interferon- γ release assays and tuberculin skin test in predicting the development of active tuberculosis （UK PREDICT TB）： Prospective cohort study[J]. Lancet Infect Dis，2018，18：1077-1087.

[4] Whitworth HS，Badhan A，Boakye AA，et al. Clinical utility of existing and second-generation interferon-γ release assays for diagnostic evaluation of tuberculosis：An observational cohort study[J].Lancet Infect Dis，2019，19：193-202.

[5] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplificatione of DNA [J].Nucleic Acids Res，2000，28（12）：e63.

[6] 路丽苹，陆斌，刘梅，等.GeneXpert MTB/RIF技术在结核病早期诊断中的应用[J].中国防痨杂志，2017，39（1）：71-75.

[7] 江载芳，申昆玲，沈颖，等.实用儿科学[M].第8版.北京：人民卫生出版社，2015：1093-1094.

[8] 赵雁林，欧喜超，李强，等.结核病实验室诊断技术培训教程[S].北京：人民卫生出版社，2014.

[9] Chen P，Shi M，Feng GD，et a1.A highly efficient Ziehl—Neelsen stain：Identifying de novo intracellular and improving detection of extracellular Mwobacterium tuberculosis in cerebrospinal fluid[J].J Clin Microbiol，2012，50（4）：1166-1170.

[10] 罗槑，徐园红.结核感染T细胞检测在菌阴肺结核诊断中的应用价值[J].国际检验医学杂志，2016，32（8）：1035-1038.

[11] 丁卫忠，陈巍，石莲，等.环介导等温扩增法对痰标本中结核分枝杆菌检测效果的评估[J].中国防痨杂志，2016， 38（10）：818-812.

[12] 杨元利，张永峰，刘元，等.GeneXpert Mtb/RIF技术对成年人结核性脑膜炎诊断价值的研究[J].中国防痨杂志，2017，39（9）：970-974.

[13] World Health Organizationg.Global tuberculosis report 2017[R].Geneva：World  Health Organization，2017.

[14] 张同强，孙琳，徐勇胜，等.结核性脑膜炎评分系统对儿童结核性脑膜炎的诊断价值[J].中国防痨杂志，2018， 40（9）：932-939.

[15] 白文靜，胡型忠，施伎婵，等.外周血结核感染 T 细胞斑点试验在结核病中的应用价值研究[J]. 浙江医学，2015，37（14）：1209-1211，1218.

[16] 徐丽丹，王凯旋，李小兵，等.结核感染T细胞斑点试验与结核菌素试验在诊断儿童结核感染中的价值比较[J].北京医学，2019，41（11）：1007-1009.

[17] 杜伟勤，薛婷，王桂琴.环介导等温扩增法检测结核分枝杆菌的应用[J].中国当代医药，2018，25（15）：123-126.

[18] 孙雯雯，肖和平.环介导等温扩增技术早期诊断结核性脑膜炎的研究[J].中国防痨杂志，2016，38（12）：1102-1108.

[19] Shrestha P，Khanal H，Dahal P，et al.Programmatic impact of implementing GeneXpert MTB/RIF assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens from pulmonary tuberculosis suspected patients in resource limited laboratory settings of Easten Nepal[J].Open Microbiol J，2018，12：9-17.

（收稿日期：2020-04-14）