豚草粗提物对杨树水泡型溃疡病的抑菌作用研究

矫丽曼 彭儒胜 冯连荣 李晓宇 赵大根 张妍 纪纯阳

摘  要：为解决豚草提取物在林业病虫害防治中的推广与应用问题，以豚草叶片为试验材料，采用温浸-超声波联合提取法提取抑菌活性物质，并开展其对杨树水泡型溃疡病病原菌的室内外抑菌试验。室内抑菌试验表明，粗提物浓度为16 mg/mL时，抑菌率达到73.62%;林间防治试验表明，最小抑菌浓度为  40 mg/mL，抑菌率达到95.14%。通过以上抑菌试验确定豚草粗提物对杨树水泡型溃疡病有较好的抑制效果。

关键词：豚草;杨树;水泡型溃疡病;抑菌率;林间防治

中图分类号：S763.11    文献标志码：A    论文编号：cjas20200300043

Abstract： In order to solve the problem of popularization and application of Ambrosia artemisiifolia extract in the prevention and control of forest diseases and insect pests， A. artemisiifolia leaves were used as the experimental materials， and the antibacterial active substances were extracted by the method of warm soaking and ultrasonic extraction. In addition， the indoor and outdoor bacteriostatic tests of the extracts against the pathogen of poplar Botryosphaeria dothidea were carried out. Indoor bacteriostatic test showed that the bacteriostatic rate reached 73.62% when the concentration of crude extract was 16 mg/mL. Field control test showed that the minimum bacteriostatic concentration was 40 mg/mL， and the bacteriostatic rate reached 95.14%. The above results show that the crude extract of A. artemisiifolia has a good inhibitory effect on poplar B. dothidea.

Keywords： Ambrosia artemisiifolia; Poplar; Botryosphaeria dothidea; Bacteriostatic Rate; Forest Control

0  引言

豚草（Ambrosia artemisiifolia）屬菊科（Compositae）豚草属（Ambrosia），又名艾叶破布草、美洲艾，一年生草本植物，原产于美国，20世纪30年代初传入中国东部沿海，现在国内广泛分布[1-2]。豚草是国内第一批被列为已形成严重危害的外来入侵物种之一，它侵入农田、果园、城镇、绿化带和公路沿线，对当地的生态环境和人畜健康构成了严重威胁。同时豚草花粉极易引起过敏反应，极低浓度会对敏感者造成鼻炎和少数皮肤炎及荨麻疹等过敏反应，浓度稍高就会对过敏者产生长期过敏反应[3-4]。许多学者对豚草进行了各方面的研究，主要包括分类学、形态学、生理生态学、种群生态学等，证实其含有丰富的倍半萜内酯类化合物，具有化感、杀虫抑菌、灭螺等多种生物活性[5-7]。

杨树溃疡病是危害杨树最严重的病害之一，苗木、幼树、大树均可受到该病的侵害，是阻碍杨树产业发展的重要因素之一[8-9]，一般可将杨树溃疡病分为水泡型和大斑型2种类型[10-11]。杨树溃疡病常采用化学农药防治，不仅对树木本身造成伤害，还污染林木周围的生态环境。

豚草作为一种新型植物源农药的植物资源，在杨树病虫害方面应用较少，尤其在杨树溃疡病防治方面还未见报道。笔者开展豚草粗提物对杨树水泡型溃疡病的抑制作用研究，以期为新型植物源农药的开发提供前期的理论基础，为推进植物源农药在林木病虫害防治中的应用与推广提供依据。

1  材料与方法

1.1  植物材料

豚草采自辽宁省盖州市高丽城和西海等地区。新林1号杨植于国有新民机械化林场林地内，5年生，密度4 m×6 m。

1.2  试验菌株

杨树水泡型溃疡病菌株购自中国林业科学院林业菌种保存中心，编号为8090。

1.3  豚草叶片的预处理

将采集的豚草叶片用清水洗净，放于通风阴凉处阴干，再用50℃烘箱烘干至恒重后，用中药材粉碎机粉碎1 min，称重分装于棕色试剂瓶中，放于阴凉处保存备用[12-13]。

1.4  室内抑菌试验

1.4.1  豚草粗提物的提取  采用温浸-超声波联合提取法从豚草叶片中提取活性物质。称取10 g豚草叶片粉末加入到500 mL烧杯中，加入75%的乙醇溶液200 mL，用塑料膜封口，超声波45 min，40℃水浴24 h。取出样品，进行真空抽滤。使用旋转蒸发器（40℃，80～        120 r/min）减压浓缩，浓缩直至无溶剂滴出，即得膏状的粗提物，将其转移至小烧杯或平皿中，于40℃烘箱中烘干称重，放入4℃冰箱中保存备用[14-15]。

1.4.2  含豚草粗提物培养基的制备  杨树水泡型溃疡病病原菌的培养采用PDA培养基，称取去皮的土豆200 g，加入1000 mL蒸馏水中，水煮30 min，中间用玻璃棒搅拌，用4层纱布过滤，将滤液定容至1000 mL，加入琼脂和糖各20 g，加热至完全溶解，分装于三角瓶中，每瓶装90 mL，121℃灭菌30 min[16]。

灭好菌的培养基趁热放于无菌的超净工作台中，当培养基的温度降至40℃左右时，将各浓度梯度的豚草粗提物溶液10 mL分别加入培养基中，以加水为空白对照，使其终浓度分别为0、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0 mg/mL，混合均匀后每瓶倒3个平皿，待培养基冷却后得到含不同浓度的豚草粗提物PDA培养基[17]。

1.4.3  接种  在无菌条件下，用直径6 mm的无菌打孔器在预先培养好的杨树溃疡病病原菌菌株平面上打孔，打成圆形的菌丝片，用无菌镊子夹取菌丝片放于含豚草粗提物的培养基中，每皿接种1块，用封口膜封好，放于25℃的生物培养箱中培养[18-19]。

1.5  林间防治试验

林间防治试验地点位于辽宁省新民市国有机械化林场，新林1号杨为自然发病。对树干下部1.5 m以下水泡型溃疡病病斑进行小范围的防治试验。将豚草粗提物配制成20、40、80、120 mg/mL浓度的溶液，用钢丝刷划破病斑外皮，用刷子涂抹各浓度的粗提物溶液，同时以5%的纯碱溶液为对照，选取3个连续区域，每个区域60棵树，每个处理10棵，每隔2天观察一次病斑的变化情况，通过统计分析确定防治效果，得到适宜的抑菌浓度[20-22]。

1.6  统计方法

1.6.1  室内统计方法  采用生长速率法测定菌丝生长抑菌率。培养的菌丝，每12 h观察一次菌丝的生长情况，用十字交叉法测量菌落直径，取2次的平均值，计算抑菌率[23-24]，如式（1）～（2）。

[抑菌率=对照生长直径-处理生长直径对照生长直径×100%]…（1）

生长直径=测量直径的平均值-菌丝片的直径（6 mm）…（2）

1.6.2  林间统计方法  每2天观察一次病斑的变化，统计病斑的抑制情况，计算出平均抑菌率[25-26]，如式（3）。

[抑菌率=抑菌病斑数处理病斑数×100%]…（3）

2  结果与分析

2.1  室内抑菌试验结果

通过试验得到不同浓度的豚草粗提物对杨树水泡型溃疡病有较好的抑菌作用，并随浓度的增加而增大。溃疡病的病原菌菌丝生长快，不同观察统计时间其各浓度的抑菌率见表1。豚草粗提物抑菌浓度为   8 mg/mL时，平均抑菌率为60.56%;浓度为16 mg/mL时，抑菌率达到73.62%，因此豚草粗提物对杨树水泡型溃疡病病原菌有明显的抑菌效果。菌丝生长情况见图1，对照菌落菌丝向外延伸至平皿边缘，而豚草粗提物抑制后的菌落菌丝延伸很小，都未产生孢子，菌落为白色。

2.2  林间防治试验结果

根据室内的试验结果，需要增大豚草粗提物的浓度才能达到更好的抑菌效果，设置了20、40、80、     120 mg/mL 4个浓度的豚草粗提物溶液。不同浓度提取物对杨树水泡型溃疡病的林间防治效果都达到85%以上（表2），对照的抑菌率为90.14%，粗提物浓度为20 mg/mL抑菌率低于对照，其他浓度的抑菌率高于对照组，均达到95%以上。抑菌效果随着豚草粗提物浓度的增加而缓慢增大，从药剂使用量和抑菌效果综合考虑，林间防治杨树水泡型溃疡病的最小粗提物浓度为40 mg/mL。防治效果见图2。

3  结论与讨论

室内外的抑菌试验发现，豚草粗提物对杨树水泡型溃疡病有较好的抑菌效果，抑菌率随着粗提物浓度的增加而增大。室内抑菌试验，当浓度达到16 mg/mL时，抑菌率达到73.62%;林間防治试验，确定最小的抑菌浓度为40 mg/mL，抑菌率达到95.14%。林间防治试验在室内试验的基础上加大了豚草粗提物的浓度，得到较高的抑菌率。

本研究是植物源农药豚草提取物防治杨树溃疡病的尝试性试验，今后还要开展豚草粗提物与广谱杀菌剂的抑菌效果比较，需进一步对豚草粗提物的药效成分及作用机理进行研究，为研究开发林业用植物源抑菌剂提供更多理论依据，为确定用于生产和防治工作的新型植物源农药提供前期研究基础，使豚草这种入侵植物变废为宝，推进无公害农药的研究和应用。

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