FQ-PCR方法检测结核杆菌的应用研究

刘美兰 福建省顺昌县医院检验科 353200

结核病是一种常见的慢性传染性疾病，由结核杆菌感染所致，多发于青年时期，潜伏期1～2个月不等，可出现在人体各种器官中，肺部相对多见，多数患者呈慢性发作，主要表现为低热、乏力、咳嗽、咯血等，对患者正常工作和生活有着较大影响，甚至会危及患者生命安全[1]。这就需要临床工作者认识到结核病变早期诊断工作的重要性，在此基础上制定出科学规范的治疗方案。结核杆菌检测被认为是结核病变诊断与治疗工作开展的依据，痰涂片和痰培养法是以往检测结核杆菌的常用方法，以培养法为金标准，尽管存在一定的应用价值，但受耗时长、操作复杂、敏感性差等因素的影响，推广应用价值不高[2]。荧光定量聚合酶链式反应(Flourescent quantitative PCR，FQ-PCR)是一种新型定量实验技术，可对待测样本的初始浓度进行测定，与传统检测方式相比，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，逐渐在病原体的检测中被广泛应用[3]。为深入探讨FQ-PCR在结核杆菌检测中的作用，我院以收治的部分疑似结核病变患者为研究对象，对FQ-PCR的应用价值进行如下探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月—2019年9月收治75例疑似结核病变患者作为观察对象。其中男40例，女35例，年龄28～70岁，平均年龄(44.72±6.96)岁。纳入标准：(1)存在低热、乏力、咳嗽、咯血、盗汗、消瘦等结核病变典型症状表现；(2)年龄≥18岁；(3)患者对本研究知情同意，自愿参与。排除标准：(1)重要脏器功能异常者；(2)合并其他系统感染者；(3)精神状态不佳，配合度差者。

1.2 方法

1.2.1 标本收集与处理：标本收集：于患者入院后给予带盖无菌样本盒，告知患者留取痰标本的方式：晨起漱口，咳出1～2口深部痰置入样本盒送至检验科微生物室进行检测。标本处理：在获得的痰液标本中加入1～2倍体积的4%的NAOH，振荡混匀2min，然后室温放置15min，期间震荡数次，以保证痰液能完全液化。取1.2ml液化充分的痰液12 000r/min离心3min，弃上清留沉淀，加入1.2ml PBS液，震荡混匀沉淀，12 000r/min离心3min离心弃上清留沉淀。重复一次洗涤步骤。加入TB提取液混匀沉淀物，95℃热裂解15min后平衡至室温，备用。(备注：如果标本黏稠可适当增加痰液化工作液的使用量及延长振荡混匀时间)加样，加入提取好的待检DNA、阴、阳性对照25μl混匀试剂。

1.2.2 仪器和试剂：厦门致善生物科技股份有限公司生产的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒、检测仪器为西安天隆科技有限公司生产的多通道荧光定量分析仪，美国BD公司生产的结核杆菌快速培养系统和配套试剂。

1.2.3 痰涂片和快速培养法:痰涂片参照相关标准程序制作痰膜、抗酸染色，并对结果进行判定；痰培养法：用带有刻度的无菌毛细血管吸取0.5ml经消化洗涤、离心处理的痰液，放置于培养管，另加添加剂0.8ml，在培养仪器中进行培养，按照1次/h的频率使用荧光强度记忆探测器对培养管内荧光强度进行测定，对结核杆菌生长情况予以判定。

1.2.4 FQ-PCR：待测标本为经离心处理后的沉淀物，参照试剂盒说明书进行DNA扩增，扩增条件：93℃预变性2min，93℃ 45s、55℃ 60s，共进行10个循环的扩增；随即以93℃变性45s、55℃变性45s进行30个循环的扩增，根据试剂盒说明书进行结果的判定。

1.3 观察指标 (1)对比痰涂片和FQ-PCR对结核病变和非结核病变的阳性检出率。(2)以痰培养法为金标准，对痰涂片和FQ-PCR的疾病诊断情况及诊断敏感性、特异性、准确性、漏诊率和误诊率进行比较。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0软件分析所得数据，疾病检出率和诊断价值经百分数(%)表示和χ2检验，P<0.05提示数据有差异。

2 结果

2.1 两种方式疾病检出率对比 痰培养法检测结果显示，75例疑似结核病变患者中，42例为结核病变患者，33例为非结核病变患者。FQ-PCR对结核病变和肺结核病变的检出率为95.24%，非结核病变检出率为90.91%，与痰涂片的80.95%和69.70%相比，有统计学差异存在(P<0.05)，见表1。

表1 两种方式疾病检出率对比

2.2 两种方式疾病诊断价值对比 以痰培养法为金标准，进行痰涂片和FQ-PCR对结核病变检测结果见表2。FQ-PCR对结核病变的诊断敏感性、特异性和准确性高于痰涂片法，漏诊率和误诊率低于痰涂片法(P<0.05)，见表3。

表2 两种方式疾病检测结果对比(n)

表3 两种方式疾病诊断价值对比(%)

3 讨论

结核病是多发的慢性传染性疾病，对患者身心健康有着严重影响，多由结核杆菌感染所致。结核杆菌通常累及患者肺部和淋巴系统，也可感染中枢神经系统、循环系统、骨骼、关节和皮肤等组织脏器，引发相应的症状表现。流行病学研究显示[4]，我国结核病发病率仅次于印度，是当前阶段乃至今后很长一段时间内重点控制的重大疾病之一。

结核杆菌感染率高，以隐性感染为主，多数感染者发病前往往存在肿瘤、糖尿病、免疫抑制剂使用史、营养不良等基础病变，肺结核是结核病变中的常见类型，以咳嗽、咯血、低热、乏力、消瘦为主要表现，也有患者发病过程中症状表现典型性不足，影响疾病诊治工作的开展[5]。痰培养法和痰涂片是结核杆菌常用的检测方式，前者为检测金标准，但细胞壁脂质含量过高使得培养速度减慢，需2～8周方可完成1个培养周期，耗时长，易耽误最佳治疗时机，加重患者原有疾病。痰涂片操作简便，可行性强，但易受到标本和其他非结核性抗酸杆菌的影响，敏感性较低，易导致假阳性，对结核杆菌的诊断价值不高[6]。

FQ-PCR是近些年新兴的检测技术，可在短时间内将基因片段扩增至原来的数十万倍甚至是百万倍，与传统PCR法相比，在单一检测试管中进行整个检测过程，污染小，可自动获得判定结果，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、可重复进行等优势，被广泛应用于临床检验工作中，在病原体的检测和感染性疾病的鉴别诊断中发挥着重要作用[7]。

本文结果得出，FQ-PCR对结核病变和非结核病变的检出率高于痰涂片检查，数据间存在差异(P<0.05)，所得结论与学者张辉等人的研究成果存在一致性[8]；两种检测方式对结核病变的诊断敏感性、特异性、准确性、漏诊率和误诊率的对比间有统计学差异(P<0.05)，充分体现了FQ-PCR在结核杆菌检测中的作用。

总之，将FQ-PCR法运用至结核杆菌临床检测，快速、简便。可定量操作，利于提高结核病变检出率，可作为痰培养法的辅助手段，对结核病变的诊断有着明显的应用价值。