干细胞治疗2 型糖尿病及其并发症的研究进展

李欣悦,李 倩,石桂英,黄艺滢,雷雪裴,白 琳∗

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021;2.北京师范大学生命科学学院,北京 100875)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种因多种致病因素引起胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而导致患者出现慢性高血糖为主要特征的代谢性疾病。患病早期可通过胰岛素补充或促进胰岛素分泌控制恢复血糖正常,晚期胰岛β 细胞损伤严重导致功能衰竭,糖、脂类、蛋白质代谢紊乱,累积神经系统、心血管、肾、眼器官,导致糖尿病脑病、糖尿病肾病、视网膜病等继发性并发症[1]。 根据美国糖尿病学会(ADA)分型方法可为1 型糖尿病、2 型糖尿病、妊娠期糖尿病及特殊类型糖尿病。 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM) 又称为非胰岛素依赖型糖尿病,由于胰岛素抵抗的背景下β 细胞功能障碍,常伴随胰岛素分泌的逐渐减少[2]。 胰岛素的低敏感促使葡萄糖在肝中产生增加,肌肉和脂肪组织中吸收减少,引发高血糖症。 β 细胞功能缺陷影响了胰岛素敏感组织之间的反馈调节,造成葡萄糖稳态失衡[3]。 2 型糖尿病占糖尿病患者总数的90% 以上,其病因多样,致病机制尚不明确。

目前2 型糖尿病患者血糖控制方式主要为口服降糖药物、外源性胰岛素补充。 2 型糖尿病治疗的一线药物为二甲双呱,且可在多药物联合治疗中作为基础用药[4],可有效控制肝葡萄糖增加并改善外周胰岛素抵抗。 对于二甲双胍不适用的治疗者,可联合不同机制降糖药物进行二联治疗或三联治疗[4]。 外源性胰岛素补充主要用于1 型糖尿病的治疗。 对于2 型后期患者随病程进展,对二甲双呱不适用或联合胰岛素促泌剂或α-糖苷酶抑制剂治疗血糖仍不达标的患者,应加用基础胰岛素或预混胰岛素进行多手段联合控制,以减少并发症的危险。 依赖外源性胰岛素长期性注射的治疗方式会发生耐药性和急性低血糖的风险,对已经出现了广泛耐药性2 型重度患者可通过胰岛移植治疗。 对存在严重并发症导致器官功能损伤如糖尿病肾病肾衰竭者,需通过透析及胰—肾联合移植治疗。 成功的同种异体移植可实现胰岛功能恢复[5],为机体产生稳定的胰岛素提供了一种更长久的方法,但是它仍然面临着供体缺乏和终身免疫抑制的挑战。

糖尿病现阶段治疗仍受到终身服药和低血糖症风险的限制,近年来随着干细胞逐渐被用于多种重大疾病的临床治疗,干细胞治疗糖尿病的研究也取得较大成果。 通过功能性干细胞移植,修复胰岛素抵抗组织,保护和再生胰岛β 细胞,以长期稳定恢复胰岛素独立性,改善胰岛损伤的代谢紊乱[6]。可诱导分化为胰腺β 细胞用于糖尿病治疗的常见干细胞有:胚胎干细胞、成体干细胞及诱导性多能干细胞。 查询ClinicalTrials.gov 有关干细胞治疗2型糖尿病及其并发症临床试验信息约76 项,在中国、印度、美国等国家已进入1 期/ 2 期临床试验阶段,其中包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带血间充质干细胞,大多数干细胞对2 型糖尿病治疗的研究还处于实验动物水平。 表1 列举了几项具有代表性的干细胞治疗2 型糖尿病相关临床研究项目。

1 胚胎干细胞治疗

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是一类高度未分化的细胞,由早期胚胎或原始性腺中分离得到,可分化可形成体内不同类型细胞,发育成为内、中、外三个胚层的细胞组织,具有高度全能性,且在体外可长时间维持多能性和自我更新的能力。由于ESCs 在细胞移植治疗中,具有低免疫原性,可以在体外经历多系分化,并产生一系列分化良好的后代[7-8],因此被广泛应用于多种疾病的治疗中,并建立了多种动物的hESCs 细胞系。 研究早期对于ESCs 的异常增殖特性关注较少,将其直接注射到成年小鼠体内会产生畸胎瘤,可被视为条件性肿瘤细胞[9-10]。 近些年来,利用定向诱导ESCs 形成功能性β 细胞团[11]或胰岛素分泌细胞(IPCs)已成为恢复胰岛功能治疗糖尿病的研究热点。 Lumelsky等[12]通过五个阶段诱导完成小鼠ESCs 向胰岛β 细胞的分化,并皮下移植到到链脲佐菌素(STZ) 糖尿病小鼠测定ESCs 分化的胰岛样细胞团的生存能力及体内功能,移植后的糖尿病小鼠可维持体重的减轻并存活更长的时间,证明了细胞移植的总体效果有益糖尿病动物的恢复,通过对ESCs 的诱导分化可产生与天然胰岛相同的生理效果,但这些细胞的胰岛素表达量却远低于天然胰岛的胰岛素分泌水平,导致高血糖症状恢复不明显。 Sui 等[13]用小鼠RIP-YFP 质粒构建体稳定转染未分化的ES 细胞系,测定了由ESCs 分化的胰腺内分泌细胞其胰腺特异性基因表达,发现这些胰岛素分泌细胞共表达了INS1、INS2、Islet1、MafA、IA1 等胰岛β 细胞的表型标志物,表明ESCs 分化的胰腺内分泌细胞与体内成熟的胰岛β 细胞有相似的基因表达模式,建立了从ESCs 到胰腺内分泌细胞系的有效分化策略。同时还证明了锌作为的介导细胞胰岛素分泌上调的诱导剂可显着促进诱导ESCs 向胰岛素分泌细胞的分化,为ESCs 分化功能的调节提供了新思路。

ESCs 向胰岛样细胞分化用于治疗糖尿病还存在多种问题: 细胞转化效率低, 诱导分化产生的IPCs 数量有限;IPCs 胰岛素分泌量少,其胰岛素分泌功能仅能达到体内成熟胰岛β 细胞的1 / 50;IPCs诱导周期长,从ESCs 分化至IPCs 需经历向限定内胚层细胞、后部前肠细胞、胰腺内胚层细胞、胰岛前体细胞的诱导过程,最终分化成为胰岛素分泌细胞,此诱导周期需要约28～32 d。 因此,研究胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞方向分化调控机制,提高ESCs 来源的IPCs 分化效率,以获得高浓度高纯度的成熟胰岛素,成为应用ESCs 治疗糖尿病的重点问题。 目前已发现通过生长因子(如bFGF)及诱导因子激活素A ( Activin A)[14]、 丁酸钠、 唾液素4(Exendin 4)、尼克酰胺(Nic)、转录因子PDX1 等可促进ESCs 向IPCs 的分化及成熟[11]。

ESCs 移植治疗糖尿病的研究还处于临床前阶段,ESCs 的体外诱导分化机制尚未阐明,安全性还无法保证,且ESCs 用于临床试验的伦理问题还存在争议,因此建立安全可靠的临床级ESCs 系,有效解决异种移植排斥等技术问题有待进一步解决。

2 成体干细胞治疗

2.1 胰腺干细胞治疗

胰腺干细胞为能够自我复制增殖的,未达到终末分化状态的前体细胞群,能被定向诱导为具有胰岛素分泌功能的类胰岛细胞,形成胰岛组织结构,维持血糖水平恒定[15]。 一直以来胰腺中存在具胰岛再生潜能的祖细胞的说法并未得到验证,2018 年Qadir 等[16]证实了成年人类胰腺中存在祖细胞,提出了导管和腺体网络中特定的解剖位置,并证实了在特定刺激下其增殖分化为葡萄糖反应β 细胞的潜能。 目前胰腺干细胞的分离获取主要来源于胰岛实质、胰腺导管上皮及胰腺腺泡等组织[17]。 但对于胰腺干细胞的鉴定尚无统一方法,在其增殖分化不同生理阶段,其分子标记物随基因在不同时期的表达呈现一定差异,其细胞形态也存在改变[18]。 目前的研究中常采用胰腺细胞所表达的蛋白作为标志物对其鉴定,如胰十二指肠同源框基因-1(PDX-1)编码的PDX1 蛋白、在发育过程中的胰腺内胚层上皮细胞存在高表达的细胞角蛋白19(CK19)、巢素蛋白(nestin)及神经元素3(NGN3)[19]。

表1 2 型糖尿病干细胞移植治疗相关临床研究Table 1 Clinical study on the treatment of type 2 diabetic stem cells

在胰腺干细胞治疗中,移植部位的选择仍需进一步研究。 刘智伟等[20]分别于门静脉肝内手术移植胰岛细胞和胰腺干细胞,对两组移植大鼠血糖浓度、胰岛素水平、血清C 肽水平进行监测,并比较术后移植物数目、纯度、活性及存活时间的差异。 实验结果显示,胰腺干细胞移植组较胰岛细胞降糖作用缓慢,且胰岛素分泌量低于胰岛细胞移植组,但术后一段时间后随胰岛干细胞分化血糖水平明显下降,胰岛素分泌量持平。 经分离过程,胰腺干细胞与胰岛细胞存活率相近但分离纯度较低,移植晚期胰腺干细胞移植物仍可保持较长的存活时间,此时胰腺干细胞移植组胰岛素分泌量高于胰岛细胞移植组。 可推断糖尿病大鼠胰腺干细胞移植治疗效果优于胰岛细胞,具有持续降糖能力,且诱导分化后经门静脉注射移植可更有效地发挥疗效。

2.2 间充质干细胞治疗

脂肪间充质干细胞 ( adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs) 在体外经多次传代仍保持其多潜能性,可向脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、胰岛细胞等方向诱导分化,具有免疫调剂功能,取材简单来源丰富,应用潜力巨大。 Cao 等[21]的研究中发现,高脂饮食诱导的肥胖小鼠经静脉注射脂肪来源的间充质干细胞后,体内葡萄糖水平维持在稳态,胰岛素抵抗作用明显降低。 Timper 等[22]将人源脂肪间充质干细胞分化为IPCs,表达出胰岛素,生长抑素和胰高血糖素,并发现增殖的ADMSCs 存在胰岛β 细胞发育转录因子PAX6 和IsL-1 的表达。

骨髓间充质干细胞( bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs) 移植排斥反应较弱,具有免疫调节及抗炎作用,在自身免疫病治疗中有着重要地位,因此可能对于1 型糖尿病具有较好的治疗作用。 有研究表明,在链脲佐菌素糖尿病的动物模型中,采用BMSCs 分化为胰岛细胞或胰导管细胞进行治疗可以有效降低血糖[23-24]。 Xie等[25]成功将人BM-MSCs 诱导分化为IPCs, 这些IPCs 表达了与胰岛β 细胞发育及功能相关的多个基 因, 包 括Glut2、 PAX6、 巢 蛋 白、 PDX1, NGN3、NKX6.1、ISL-1、Beta2 / Neurod、胰岛素和胰高血糖素。 Gabr 等[26]也通过移植成熟骨髓间充质干细胞控制链脲佐菌素裸鼠的糖尿病。

自体骨髓源性干细胞移植已进入临床试验阶段。 2007 年,Bhansali 等[27]筛选10 名对三种口服抗糖尿病药物(磺酰脲、二甲双胍和TZD)均产生抵抗且病情持续时间达到5 年的T2DM 患者,通过股动脉途径在十二指肠动脉处对其进行骨髓间充质干细胞移植治疗。 治疗6 个月后,胰岛素需求减少了50%以上,HbA1c 降低,胰高血糖素刺激的C 肽水平有所改善,且没有发现严重的不良反应。 表明自体骨髓源性干细胞移植有望作为改善T2DM 患者β 细胞功能的一种安全有效的治疗方法。

脐带血间充质干细胞( umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs) 为中胚层发育而来的原始间充质细胞群,其具有与骨髓间充质细胞相似的生物学特征,但其增殖能力比骨髓来源的间充质细胞快数倍。 因其易快速增殖、具有多向分化潜能,且多来源于生产废物,无伦理限制,具有重要临床应用价值。 Gao 等[28]团队在高葡萄糖,视黄酸,烟酰胺,表皮生长因子和exendin-4 的条件下,经15 d 将人脐带血间充质干细胞体外分化为胰岛样细胞簇,分化后约9 d 开始表达相关胰腺细胞标志物,包括胰岛素,胰高血糖素,Glut-2,PDX1,PAX4 和NGN3。 Sun 等[29]通过缺氧治疗从脐带血来源的间充质干细胞成功获得了功能性IPCs,并阐明了缺氧诱导β 细胞的发育途径,即低氧诱导时c-Met 启动了MSCs 向IPCs 的早期分化,HGF 通过诱导NGN3 的表达调控IPCs 的完全分化,证明了c-Met 与HGF 之间的相互作用可增强MSCs 分化为IPCs 的功能,提高IPCs 的生存能力。

3 诱导性多能干细胞治疗

诱导性多能干细胞( induced pluripotent stem cells,iPSCs)是一种细胞类型及表观遗传学同胚胎干细胞相似,具有自我更新和多向分化潜能的一类细胞类型,来源于普通体细胞,利用病毒载体导入特定转录因子诱导其发生转化,重编程为具有多能性的细胞系。 目前研究中诱导iPSCs 定向分化为IPCs 的形式主要有两种:一是于体外坏境下加入特定诱导因子诱导iPSCs 的定向分化;二是通过基因工程转入调控胰岛β 细胞的转录因子,促使iPSCs的分化形成。 Kunisada 等[30]结合五个hiPSCs 细胞系的研究发现,激活素A 和GSK3β 抑制剂处理可有效增强内胚层分化,与视黄酸,骨形态发生蛋白抑制剂以及TGF-β 抑制剂联合使用可诱导内胚层向胰腺干细胞的分化。 在此过程中,胰腺干细胞标记物PDX1 和NGN3 的表达显着增加,大部分细胞抗PDX1 抗体呈阳性。 同时该团队发现了几种化合物,包括毛喉素,地塞米松和TGF-β 抑制剂,可诱导胰岛素产生细胞从胰腺干细胞分化。 Gupta 等[31]在hiPSCs 细胞系的内源性NKX6.1 基因座中插入GFP报告基因,NKX6.1-GFPiPSC 报告了NKX6.1 在胰腺分化中的表达。 通过RNA 测序对基因表达谱分析并对细胞进行分选,结果表明来自分化的NKX6.1 阳性细胞与人自然β 细胞转录组图谱极为相似。 王雷[32]采用PDX1、NeuroD 和MafA 修饰的iPSCs 对糖尿病小鼠进行移植治疗,证明了移植后的鼠源iPSCs 基因胰岛素表达上调。 而占小波[33]通过实验证明了,Pdx1 通过激活其下游基因Ngn3 和Pax6 促进iPSCs向胰岛素分泌性细胞分化。

iPSCs 相比较于胚胎干细胞应用于临床治疗更避免了伦理和移植问题。 有研究显示,到2015 年对人类诱导多能干细胞(hPSCs)的研究就超过了人类胚胎干细胞(hESC) 的研究,并在此后逐年迅速增长,针对于特异性疾病临床级别hESC 系也不断被建立和维持[34]。 目前没有针对T2DM 的hPSCs 临床治疗,而4 项有关hPSCs 制品VC-01 和VC-02 对T1DM 患者的安全性、耐受性和疗效的临床试验已在美国和加拿大进入1 期/ 2 期临床阶段。 表2 列举了以上几种干细胞治疗T2DM 的对比。4 总结与展望

表2 不同来源干细胞移植治疗T2DM 的研究对比Table 2 Comparison of different sources of stem cell transplantation in the treatment of T2DM

糖尿病作为多因素导致的慢性代谢性疾病,伴随着多种并发症发生,治疗药物价格高昂、依赖性大且无法从根本上恢复胰岛素独立性。 2 型糖尿病为进展性疾病,随自然病程发展对外源性血糖控制的依赖逐渐增大[4],且无法有效避免多组织病变的并发症发生,存在着较大局限性。 随着近年来干细胞研究的深入,通过干细胞移植疗法恢复胰岛功能给糖尿病的治疗提供了全新思路。 干细胞具有高度全能性或多能性,可向着多种组织细胞分化,在体外可自我复制增殖,并维持与亲代细胞相同的种群特征,利用其定向诱导分化为具有产生胰岛素功能的胰岛素分泌细胞可减轻甚至摆脱患者对胰岛素的长期依赖。 现已研究发现多种诱导蛋白(Activin A,Exendin 4 等)转录因子(PDX1、PAX6 和IsL-1 等)对胰岛细胞的成熟和诱导分化起到调控作用,但大部分干细胞分化、胰岛细胞发育及其调控机制尚未得到解答,仍需进一步研究。

目前多种干细胞已在治疗2 型糖尿病的相关研究中取得进展,包括了ESCs、PSCs、MSCs 及iPSCs。PSCs 分离困难;ESCs 和iPSCs 具有较强的增殖分化潜能,但ESCs 存在较大伦理限制,而iPSCs 由重编程得到,存在一定安全问题;MSCs 具有较高安全性,且作为成体干细胞避免了伦理争议,但其细胞分离率、增殖效率较低并伴随代次衰老。 干细胞用于T2DM 及并发症治疗的研究大部分还停留在临床前阶段,这些不同类型干细胞在作用机制上有所区别,如骨髓间充质干细胞侧重于提高β 细胞的再生能力,通过细胞输注刺激局部组织细胞再生,提供多种再生信号,增强修复作用,并改善炎症诱发病变的恢复[37];而脂肪间充质干细胞侧重于改善胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性,增加葡萄糖输注率,降低肝脏葡萄糖的释放[40]。

干细胞治疗T2DM 的研究涉及多种方向,如优化细胞分化方案、发现新的免疫调节方法、对间充质干细胞预处理促进巨噬细胞极化和自噬修复以改善代谢控制[37,41],及与基因编辑技术相结合,有望为患者带来革命性的治疗方法。

2 型糖尿病干细胞治疗研究中,不同类型干细胞到IPCs 的分化仍缺少标准化的鉴定、诱导方法,且针对不同年龄段、不同临床表现的患者,其移植细胞种类及移植方式的选择仍需经大量长期的实验观察进行综合判断。 此外,对于2 型糖尿病移植治疗过程中,还存在迁移并功能整合于受损组织的干细胞数量较少,输注干细胞转化为功能性细胞效率过低的问题,如何提高细胞胰岛素分泌量、调节宿主免疫应答、保证远期疗效稳定性及安全性问题也需更深入研究。 本文从不同类型的干细胞治疗2型糖尿病的方法、优缺点和研究进展等方面进行综述,期望对2 型糖尿病及其并发症致病机理研究、应用干细胞移植技术恢复胰岛功能以及建立干细胞安全性和有效性的评价提供一定参考。