HOX反义基因间RNA在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达及对预后的影响

付汉斌 罗琳

湖北省武汉市武昌医院口腔科，武汉 430063

唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic car-cinoma，SACC）作为唾液腺高发恶性肿瘤，具有较强的侵袭力，可沿神经或血循环发生远处转移，特别是易发生肺转移，患者总体预后不佳，死亡率较高。研究[1]表明，高复发和转移特性是导致患者死亡的主要因素。目前，对SACC复发及转移相关机制尚未完全清楚。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为一类长度在200个核苷酸以上的内源性RNA，不具有编码蛋白能力或仅能编码小分子多肽，但近年来研究发现，其参与了多种肿瘤发生、进展及侵袭转移过程，且与恶性肿瘤患者预后密切相关。

HOX反义基因间RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）作为重要的lncRNA类型，参与了多种恶性肿瘤的发生及进展过程，且有许多研究指出，HOTAIR在口腔鳞状细胞癌组织中呈高表达。本研究分析SACC组织中HOTAIR表达，探讨其与患者临床病理指标以及预后的相关性，以期为SACC机制研究及预后判断提供临床资料。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取2007年3月至2014年3月在武汉市武昌医院口腔科行手术切除治疗的SACC患者86例为研究对象，其中男性37例，女性49例，年龄23～74岁，平均年龄（53.04±12.23）岁。纳入标准：1）术前未行放化疗治疗，术后经病理学检查确诊；2）临床资料完整且完成院外随访。肿瘤部位：小唾液腺39例，大唾液腺47例。病理学类型：实体型25例，管状型29例，筛孔型32例。按照TNM分期标准：Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期48例；发生神经侵犯43例，出现淋巴结转移31例。手术过程中取SACC组织，置于冻存管中，-80 ℃保存。

同期选取因唾液腺良性肿瘤行手术治疗患者45例作为对照，留取距离肿瘤边缘>2 cm正常唾液腺组织，其中男性20例，女性25例，平均年龄（54.15±11.97）岁，与SACC患者在性别、年龄无差异（P>0.05）。本研究通过武汉市武昌医院伦理委员会批准，所有患者均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测HOTAIR表达水平 取SACC组织和正常唾液腺组织，剪碎后研磨，按总RNA提取试剂盒（上海市闪晶分子生物科技有限公司）用Trizol法提取总RNA，使用分光光度计（日立公司，日本）检测总RNA纯度，OD260/OD280在1.80～2.20为纯度高。使用逆转录试剂盒（大连市宝生物工程有限公司）对总RNA进行逆转录，获得互补DNA（complementary DNA，cDNA）。按照PCR扩增试剂盒（大连市宝生物工程有限公司）说明用7500型实时荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）对引物进行扩增，引物序列由上海英骏生物技术有限公司设计合成。引物序列：HOTAIR上游5’-GGGTGGCT-CACTCTTCTGGC-3’，下游5’-TGGCCTTGCCCGG-GCTTGTC-3’；β肌动蛋白上游5’-GACCTCTATG-CC AACACAGT-3’，下游5’-AGTACTTGCGCTCA-GGAGGA-3’。PCR条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，74 ℃ 30 s，循环40次。使用2 ΔΔCt法计算SACC组织和正常唾液腺组织中的HOTAIR表达水平，2 ΔΔCt表示为SACC组织较正常唾液腺组织中基因的相对表达倍数，ΔCt=Ct（目的）-Ct（内参）；ΔΔCt=ΔCt（SACC组织） ΔCt（正常唾液腺组织）。

1.2.2 病例随访 SACC患者于术后随访，随访形式包括门诊复查、电话、住院病历查阅等，随访截止日期为2019年3月31日，以死亡作为终点事件，记录患者死亡情况及生存时间。

1.3 统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料采用均数±标准差表示，SACC患者肿瘤组织和因唾液腺良性肿瘤行手术治疗患者的正常唾液腺组织间HOTAIR表达量比较采用独立样本t检验，不同病理学类型的SACC组织中HOTAIR表达量比较采用单因素方差分析；以SACC患者组织中HOTAIR相对表达量的四分位数为标准，将患者分为低表达组和高表达组，采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验对两组生存时间进行比较；以年龄、性别、肿瘤部位、病理学类型、肿瘤直径、TNM分期、神经侵犯和淋巴结转移为自变量，采用Cox比例风险回归模型对影响预后的多因素进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOTAIR在SACC组织和正常唾液腺组织中表达水平比较

实时荧光定量PCR结果显示，SACC组织中HOTAIR相对表达量为2.48±0.22，高于正常唾液腺组织的1.03±0.13，差异有统计学意义（t=39.812，P<0.001）。

2.2 HOTAIR在不同临床病理指标的SACC患者组织中表达水平比较

不同年龄、性别、部位、病理学类型和直径的SACC组织中HOTAIR相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）；与TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、未发生神经侵犯及淋巴结转移患者相比，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、发生神经侵犯及淋巴结转移SACC患者组织中HOTAIR相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 HOTAIR表达水平对SACC患者生存时间的影响

截止2019年3月31日，86例患者中46例患者死亡，随访时间9～144个月，中位随访时间51.5个月。以SACC患者组织中HOTAIR相对表达量的四分位数为标准，分为低表达组（n=22）和高表达组（n=64例）。Kaplan-Meier生存分析结果显示，低表达组患者平均生存时间（113.32±10.77）个月，累积生存率72.73%，高表达组患者平均生存时间（59.75±6.50）个月，累积生存率39.06%；Log-Rank检验示，差异有统计学意义（χ2=8.242，P=0.004），见图1。

2.4 影响SACC患者预后的多因素分析

Cox比例风险回归模型分析结果显示，神经侵犯、淋巴结转移和HOTAIR高表达是影响SACC患者预后的独立风险因素（HR=3.274、2.971、2.911，P<0.05），见表2。

3 讨论

SACC作为中老年人群的高发恶性肿瘤，发生及进展机制较为复杂，目前尚未完全清楚。随着临床上根治性手术切除联合放化疗的应用，SACC患者生存率得到提高，但由于肿瘤侵袭力强，且具有嗜神经生长的特性，治疗后易发生复发及转移，严重影响了患者生存质量及生存时间。因此，深入探讨SACC发生进展机制以及与侵袭转移相关的敏感基因或生物标志物，对患者早期诊疗及改善预后具有重要意义。

表 1 不同临床病理指标SACC组织中HOTAIR相对表达量的比较Tab 1 Comparison on the relative expression levels of HOTAIR in SACC tissues with different clinico pathological indexes

图 1 HOTAIR表达水平对SACC患者生存时间的影响的Kaplan-Meier分析图Fig 1 Kaplan-Meier analysis chart of the effect of HOTAIR expres -sion level on survival time of SACC patients

表 2 影响SACC患者预后的多因素Cox比例风险回归模型分析Tab 2 Analysis on multiple factors influencing the prognosis of patients with SACC by using Cox proportional hazards regression

lncRNA作为近年来的研究热点，其在肿瘤发生、进展及恶性生物学特性中的作用越来越受到重视，有研究[2-3]指出，头颈部恶性肿瘤组织中出现多种lncRNA表达异常。lncRNA异常表达与颈部恶性肿瘤细胞恶性增殖、迁移及侵袭密切相关。

HOTAIR作为一种lncRNA，下调其表达可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖，增强其表达则可促进细胞增殖抑制凋亡，从而促进多发性骨髓瘤对地塞米松的化学耐药性。亦有研究[4]指出，HOTAIR可促进鼻咽癌的侵袭和迁移。本研究结果显示，SACC组织中HOTAIR相对表达量高于正常唾液腺组织，说明HOTAIR在SACC组织中呈高表达，可能参与了SACC发生过程。本研究结果显示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、发生神经侵犯及淋巴结转移SACC患者组织中HOTAIR相对表达量升高，说明HOTAIR高表达可能参与了SACC恶性进展及侵袭转移过程。这些结果提示HOTAIR可能通过影响SACC细胞侵袭转移能力而参与了SACC发生及进展过程。

有研究指出，HOTAIR可作为肿瘤疾病患者的预后循环标志物。Da等[5]指出，HOTAIR的高表达水平与胃癌患者较差的生存期有关，可能是胃癌潜在独立预后生物标志物。本研究结果显示，低表达组患者平均生存时间和累积生存率均高于高表达组，说明HOTAIR表达与SACC患者生存时间和生存率有关， HOTAIR低表达患者有更长的生存时间和更高的生存率。本研究Cox比例风险回归模型分析结果显示，HOTAIR表达是影响SACC患者预后的独立风险因素，进一步说明HOTAIR表达与患者预后有关，是影响患者预后的风险因素，提示HOTAIR可能是SACC潜在的预后生物学指标。

综上所述，HOTAIR在SACC患者组织中呈高表达，与肿瘤恶性化进展及患者不良预后有关，有望成为SACC患者预后评估的潜在标志物。但鉴于本研究样本量有限，且是单中心研究，尚需进一步开展多中心、大样本的队列研究予以确证。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。