云南不明原因猝死高发地区彝族人群心脏疾病相关基因变异

（1.昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500；2.云南省地方病防治所，云南 大理 671000）

云南不明原因猝死（Yunnan sudden unexplained death，YNSUD）是指主要发生在云南一些偏远山区和半山区的一种不明原因猝死[1]。研究[2-5]结果表明，该病具有以下特点：发病迅速，病情变化快，病死率高；流行时间在6～9月，7～8月为高发季节；发病人群多为农民，以青壮年为主，女性高发；具有明显的民族、村庄和家庭聚集性，其中以彝族、汉族和傈僳族发病率较高；经尸体解剖、组织病理学检验等全面检验后仍不能明确死因。因缺乏有效的防治措施，该病已严重影响到病区的社会安定和生活、生产秩序，已成为目前云南省较为严重的地方性公共卫生问题。

YNSUD存活者的临床表现、心电图改变，部分猝死者头昏、心慌、晕厥等生前表现，以及部分猝死案例解剖所见心脏病理改变，均提示部分猝死病例可能与心脏疾病有关[6-8]。心脏疾病，尤其是心肌病和心脏离子通道疾病被认为是引起不明原因心脏性猝死的首要原因，目前已发现了数千种心脏疾病相关基因的单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV），并证明部分变异与不明原因心脏性猝死有关[9-10]。本研究利用MassARRAY质谱系统对YNSUD高发地区彝族人群25个心脏疾病相关基因的52个SNV位点进行基因分型，以探讨YNSUD的死亡原因是否与心脏疾病相关基因的SNV相关。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择YNSUD高发地区（大理州鹤庆县、楚雄州大姚县、临沧市凤庆县、丽江市宁蒗县）多个自然村彝族村民205例作为病区组（男性79例，女性126例）；以邻村（居住的自然环境相同）健康彝族村民197例作为对照组（男性91例，女性106例）。对象均来自健康体检招募并签署知情同意书，经体检并询问病史认定无重大疾病。本研究经昆明医科大学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血基因组DNA的提取

采用DP318血液基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因组DNA，操作步骤按照产品说明书进行。

1.2.2 SNV位点的选择

所有SNV位点的选择参考本课题组前期全基因组测序、全外显子测序的结果[11-12]及SNP数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp），共选出25个心脏疾病相关基因的52个SNV位点进行基因分型，所有候选SNV位点见表1。在候选SNV位点中剔除飞行时间质谱检出率低于90%以及在对照组中不符合Hardy-Weinberg平衡的位点，对余下SNV位点的等位基因频率和基因型频率进行统计分析。

表1 本研究中的52个候选SNV位点Tab.1 Fifty-two candidate SNVs in this study

续表1Continued tab.1

1.2.3 SNV的基因分型

本研究采用基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术进行基因分型。使用NanoDropTM2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）检测光密度值，确认DNA样品质量浓度≥25ng/μL，使用MassARRAY质谱系统（美国Sequenom公司）对质量检验合格的DNA样本进行检测。结合SNP数据库并使用Assay Designer 3.1软件（美国Sequenom公司）设计PCR反应和单碱基扩展引物，交由生物公司合成。主要实验步骤包括：（1）采用PCR法对含有SNV位点的DNA片段进行扩增；（2）虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）去磷酸化处理，去除体系中游离的脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）；（3）单碱基延伸反应；（4）树脂除盐纯化；（5）用MassARRAY® Nanodispenser（美国Sequenom公司）将检测样品从384孔板点样到SpectroCHIP芯片上；（6）将载有样品的芯片放入MassARRAY质谱系统中进行检测，通过MassARRAY Typer 4.0软件分析和输出分型结果，获取SNP分型数据。

1.2.4 心电图检查

使用MAC1200十二导联心电图机（美国GE公司）对病区组所有个体进行静息平卧位状态下心电图检查。设置参数：走纸速度为25 mm/s，灵敏度为10mm/mV。所有心电图检测结果均经两位专科医生分析诊断。

1.2.5 统计处理

使用SPSS 17.0软件进行统计分析。采用χ2检验分析两组间等位基因频率和基因型频率的差异，当基因型频率≤5时，采用Fisher精确检验，检验水准α=0.05。通过χ2检验判断各SNV位点的基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用蛋白功能预测软件PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）和SIFT（http://provean.jcvi.org/index.php）对两组间差异具有统计学意义的变异位点进行致病性预测。

2 结 果

2.1 基因分型结果

52个 SNV 位点中，TTN（rs72648960）、SCN5A（rs192379242）在基因分型检测中检出率低于90%，PKP2（rs1046116）、SCN1B（rs72558026）、TRDN（rs28494009）、DMD（rs228406）的基因型频率在对照组中不符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），故将上述6个SNV位点予以剔除。

本研究中，ARVC致病基因的错义变异位点DSG2（rs2278792，c.2318G＞A，p.R773K）的等位基因频率及基因型频率在病区组和对照组之间差异具有统计学意义（P＜0.05），而且该变异在病区组的等位基因频率及基因型频率均高于对照组（表2）。R773K位于DSG2基因的第14号外显子上，第773位精氨酸（R）变成赖氨酸（K）。病区组205例中，共140例（68.3%）携带R773K变异；对照组197例中，共114例（57.9%）携带R773K变异。PolyPhen-2和SIFT软件对R773K变异的致病性预测分值分别为0.027和0.210，结果均为良性。

表2 DSG2（rs2278792）在病区组和对照组的等位基因频率及基因型频率分布Tab.2 Distribution of allele frequency and genotype frequency of DSG2（rs2278792）in inpatient group and control group

2.2 心电图检查结果

病区组205例均接受心电图检查，71例（34.6%）检出心电图异常，其中54例携带R773K变异。主要检见的心电图改变有顺（逆）钟向转位、电轴左（右）偏、ST段和T波改变、窦性心动过缓（速）以及房室传导阻滞等（表3）。典型心电图改变见图1。

表3 R773K变异携带者的心电图异常情况Tab.3 Abnormal electrocardiogram of R773K variant carriers

图1 R773K变异携带者的心电图Fig.1 Electrocardiogram of R773K variant carriers

3 讨 论

自1975年YNSUD被首次报道以来，全省已上报400余起猝死病例[1]。其中部分猝死被认为与“小白菌”中毒有关，但大部分案例中的死者亲属均称死者生前从未食用过任何“小白菌”，而且在许多发病率高的村庄，没有任何“小白菌”可供食用[13]。另外，YNSUD在彝族人群中的发生率较高。因此我们提出，YNSUD可能是遗传基础与多种因素共同作用的结果。

研究[9]结果表明，心肌病与心脏离子通道疾病是引起心脏性猝死的首要病因。其中，心肌病与多种蛋白质（肌小节和桥粒等）编码基因的SNV有关，心脏离子通道疾病包括LQTS、BrS和CPVT等与编码心脏离子通道和相关蛋白基因的SNV有关[10]。同时，许多心脏疾病相关基因的SNV与心脏疾病和猝死有关[14-16]。为了探究YNSUD在彝族人群中高发的原因，本研究对YNSUD高发地区彝族人群52个心肌病及心脏离子通道疾病的SNV位点进行了基因分型，检测到ARVC致病基因的错义变异位点DSG2（rs2278792，c.2318G＞A，p.R773K）的等位基因频率和基因型频率在病区组和对照组中差异具有统计学意义（P＜0.05），而且病区组的等位基因频率及基因型频率均高于对照组。但该变异在蛋白功能预测软件PolyPhen-2和SIFT的预测分值分别为0.027和0.210，结果均为良性，尚不能认定该位点具有致病性。

本研究在病区组中检出大量顺（逆）钟向转位、电轴偏转、ST段和T波改变、房室传导阻滞等心电图异常，提示病区组人群存在的心电异常可能是YNSUD的潜在危险因子。

因YNSUD聚集区地域跨度大、各自环境封闭、各村落与外界基因交流较少，导致即使存在基因变异，也可能不同个体或者不同村落的基因变异也不一致，难以得出一个具有统计学意义的基因变异作为共同的危险因素。这就需要对每一起案件进行二代测序分析，具体问题具体分析，才可能探明其原因。

本研究在YNSUD高发地区彝族人群中检测到1个错义变异位点，其等位基因频率和基因型频率均高于对照组。这是首次对YNSUD高发地区彝族人群进行基因检测，共检测了52个SNV位点，结合基因分型结果、心电图检测结果以及蛋白质功能预测结果，尚未发现明确的可致病性突变，故彝族人群YNSUD的高发原因还有待进一步研究。

为了验证检测的SNV位点的潜在致病作用，需要在后续的研究中进行蛋白质功能的测定。此外，还需要对猝死者及其亲属进行分子研究，以便更好地评估心脏疾病相关基因变异的流行情况，特别是在具有民族和家庭聚集性的YNSUD高发地区。尽管基因变异可能是YNSUD发生的因素，但尚不能解释YNSUD的时间聚集性，因此，应对基因变异与环境的相互作用进一步研究。