高效液相色谱梯度洗脱法同时测定灵龙感冒胶囊中9种成分含量

谭东明，魏杰，尹红英

(1.江苏护理职业学院药学与中药学院，淮安 223001；2.江苏省淮安市淮阴区新渡乡卫生院，淮安 223300；3.江苏省淮安市淮阴医院，淮安 223300)

灵龙感冒胶囊收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十二册》[1]，全方由龙胆、秦艽、防己、羌活、关木通、威灵仙和甘草7味中药加工而成，具有解表清热、祛湿止痛的功效，临床上主要用于严重感冒、恶寒发热、头痛、身痛、四肢酸软、小便发黄等病症的治疗。现行质量标准未对方中任何成分进行定量检测，付成国等[2]仅对方中龙胆所含成分龙胆苦苷进行含量测定，中成药复方制剂所含成分复杂，其临床效果均为多种药材共同协同的作用，单一成分的定量研究难以有效地评价中成药复方制剂的质量。笔者参考中药质量标志物[3-5]优选原则，以“君”药首选原则，兼顾“臣”“佐”“使”代表性物质，选取灵龙感冒胶囊方中君药羌活所含主要活性成分紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素，君药龙胆、臣药秦艽所含主要活性成分龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷[6]，佐药防己[6]所含主要成分粉防己碱、防己诺林碱为定量测定研究对象，运用高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱技术，对灵龙感冒胶囊中9种成分进行同步测定，报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；METTLER TOLEDO电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，感量：0.01 mg)；KQ-250E型超声波清洗器(上海量壹科学仪器有限公司)。

1.2试剂与药品 龙胆苦苷(批号：110770-201716，含量：97.6%)、马钱苷酸(批号：111865-201704，含量：97.4%)、獐牙菜苦苷(批号：110785-201404，含量：98.3%)、粉防己碱(批号：110711-201810，含量：99.6%)、防己诺林碱(批号：110793-201807，含量：98.3%)、紫花前胡苷(批号：111821-201604，含量：99.6%)、羌活醇(批号：111820-201705，含量：99.9%)、异欧前胡素(批号：110827-201812，含量：99.6%)对照品均来源于中国食品药品检定研究院；獐牙菜苷对照品(批号：14215-86-2，含量：98.0%)来源于南京森贝伽生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯；灵龙感冒胶囊(批号：180216，180504，180811)来源于湖北虎泉药业有限公司。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：乙腈-甲醇(1：1)，流动相B：0.3%醋酸溶液，梯度洗脱(0～14.5 min，16.0%A；14.5～32.0 min，16.0%→35.0%A；32.0～47.5 min，35.0%→72.0%A；47.5～64.0 min，72.0%→81.0%A；64.0～75.0 min，81.0%→16.0%A)；0～32.0 min在240 nm波长下检测龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷[7-9]，32.0～47.5 min在280 nm波长下检测粉防己碱和防己诺林碱[6，10-11]，47.5～75.0 min在315 nm波长下检测紫花前胡苷、羌活醇和异欧前胡素[12]；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2混合对照品溶液的制备 分别精密称取龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素对照品适量，用甲醇分别制成9种单一对照品母液(龙胆苦苷7.312 mg·mL-1、马钱苷酸0.598 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.934 mg·mL-1、獐牙菜苷0.316 mg·mL-1、粉防己碱1.988 mg·mL-1、防己诺林碱0.852 mg·mL-1、紫花前胡苷2.116 mg·mL-1、羌活醇0.492 mg·mL-1、异欧前胡素4.174 mg·mL-1)；精密吸取9种单一对照品母液各2.5 mL，用甲醇制成混合对照品溶液(含龙胆苦苷0.3656 mg·mL-1、马钱苷酸0.0299 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.0467 mg·mL-1、獐牙菜苷0.0158 mg·mL-1、粉防己碱0.0994 mg·mL-1、防己诺林碱0.0426 mg·mL-1、紫花前胡苷0.1058 mg·mL-1、羌活醇0.0246 mg·mL-1、异欧前胡素0.2087 mg·mL-1)。

2.3灵龙感冒胶囊供试品溶液的制备 取灵龙感冒胶囊适量，倾出内容物，混匀，取0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取30 min，放冷，用甲醇补足减失质量，摇匀，经孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为灵龙感冒胶囊供试品溶液。

2.4阴性对照溶液的制备 按照灵龙感冒胶囊质量标准项下的处方和制备方法，分别制备缺羌活阴性样品、缺龙胆、秦艽阴性样品、缺防己阴性样品，再按照“2.3”项下灵龙感冒胶囊供试品溶液的制备方法制备3种阴性样品溶液。

2.5系统适应性实验 分别精密吸取混合对照品溶液、灵龙感冒胶囊供试品溶液、羌活阴性样品溶液、龙胆秦艽阴性样品溶液、防己阴性样品溶液各适量，依法进样测定，记录色谱图。结果所测定各成分龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素色谱峰达到了较为理想的分离效果，分离度均>1.5，理论板数按所测各成分色谱峰计均>3500，阴性样品对测定无干扰，混合对照品、供试品及阴性样品色谱图见图1。

A.混合对照品；B.灵龙感冒胶囊供试品；C.龙胆秦艽阴性样品；D.防己阴性样品；E.羌活阴性样品；1.龙胆苦苷；2.马钱苷酸；3.獐牙菜苦苷；4.獐牙菜苷；5.粉防己碱；6.防己诺林碱；7.紫花前胡苷；8.羌活醇；9.异欧前胡素。

2.6含量测定方法学验证

2.6.1线性关系考察 精密吸取“2.2”项下制备的9种单一对照品母液各2 mL，置于20 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，制成线性关系混合对照品溶液Ⅰ；精密吸取线性关系混合对照品溶液Ⅰ各适量，用甲醇依次稀释2，5，10，15，20倍，制成线性关系混合对照品溶液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ，按“2.1”项色谱条件进样测定，以进样浓度(C，μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得到9种成分线性回归方程，结果见表1。

表1 灵龙感冒胶囊中9种成分线性关系实验结果

2.6.2精密度实验 取“2.2”项下制备的混合对照品溶液，在上述色谱条件连续进样6次，记录各成分色谱峰。结果龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素峰面积的RSD分别为0.51%，0.95%，0.82%，1.01%，0.64%，0.79%，1.68%，0.85%和0.66%。

2.6.3灵龙感冒胶囊供试品溶液稳定性实验 取同一份供试品溶液，在室温下避光放置，分别在0，5，10，15，20，24 h进行测定，记录各成分色谱峰。结果灵龙感冒胶囊供试品溶液室温避光放置24 h内基本稳定，龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素峰面积的RSD分别为0.52%，0.97%，0.84%，1.07%，0.43%，1.76%，0.69%，0.83%和0.61%。

2.6.4重复性实验 取同一批灵龙感冒胶囊，按照“2.3”项下灵龙感冒胶囊供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液6份，再按照“2.1”项色谱条件进行测定，记录所测各成分的峰面积，计算各成分的含量。结果样品中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素含量的RSD分别为1.56%，1.79%，1.68%，0.88%，1.18%，1.42%，0.21%，1.71%和1.24%。

2.6.5加样回收率实验 取已知含量的灵龙感冒胶囊9份，每份0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入另行配制的混合对照品溶液(含龙胆苦苷5.308 mg·mL-1、马钱苷酸0.422 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.664 mg·mL-1、獐牙菜苷0.196 mg·mL-1、粉防己碱1.282 mg·mL-1、防己诺林碱0.538 mg·mL-1、紫花前胡苷1.366 mg·mL-1、羌活醇0.342 mg·mL-1、异欧前胡素2.728 mg·mL-1)0.5 mL3份、1.0 mL3份、1.5 mL3份，按照“2.3”项下灵龙感冒胶囊供试品溶液的制备方法制备加样回收样品溶液。在“2.1”项的色谱条件下进样检测，记录所测成分的峰面积，计算回收率、平均回收率和RSD值，结果见表2。

2.7样品测定 取灵龙感冒胶囊3批，分别按“2.3”项下灵龙感冒胶囊供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下依法进样检测，记录龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇和异欧前胡素的峰面积，以外标法计算所测9种成分的含量，检测结果见表3。

3 讨论

3.1待测定成分的选择 灵龙感冒胶囊由龙胆、秦艽、防己、羌活、关木通、威灵仙和甘草7味中药加工而成，方中龙胆清热燥湿，羌活解表散寒、除湿止痛，共为君药；秦艽清湿热、止痹痛、退虚热，威灵仙祛风湿、通经络，合为臣药；防己祛风止痛、利水消肿，关木通清心火、利小便，合为佐药，甘草调和诸药，为使药。诸药共奏，共达解表清热、祛湿止痛的功效。方中羌活为伞形科植物羌活或宽叶羌活的干燥根茎和根，主要含有香豆素类、有机酸类及挥发油类化合物，其中紫花前胡苷有镇痛、抗炎、改善学习记忆等作用，羌活醇和异欧前胡素具有镇痛、舒张血管、抗病毒活性作用[12]；龙胆为龙胆科植物条叶龙胆、龙胆、三花龙胆或滇龙胆的干燥根和根茎，秦艽为龙胆科植物秦艽、麻花秦艽、粗茎秦艽或秦艽的干燥根，龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等环烯醚萜类化合物为其主要活性成分，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、保肝利胆、解痉镇痛、增强免疫等多种活性[13]；防己为防己科植物粉防己的干燥根，粉防己碱、防己诺林碱、氧化防己碱、粉防己碱D盐酸盐等双苄基异喹啉类生物碱，为粉防己的主要活性成分[14]。笔者在本研究参考中药质量标志物优选原则，选取君药羌活主要活性成分紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素，君药龙胆、臣药秦艽主要活性成分龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷，佐药防己主要成分粉防己碱、防己诺林碱为质控指标，为灵龙感冒胶囊多组分评价模式提供数据支持。

表2 灵龙感冒胶囊中9种成分加样回收率实验结果

表3 3批灵龙感冒胶囊含量测定结果

3.2色谱条件的选择 本实验为考察不同的流动相对测定成分龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇和异欧前胡素分离效果、峰形和出峰时间的影响，对比考察了甲醇-水[6-7]、乙腈-水[6]、乙腈-0.1%磷酸溶液[6，8，10，15]、乙腈-0.3%冰醋酸溶液[6，12]、乙腈-甲醇(1：1)与0.3%冰醋酸溶液[6]等流动相，对比结果显示乙腈-甲醇(1：1)与0.3%醋酸溶液为流动相时，所测各成分分离效果和峰形综合效果最佳，出峰时间也较为理想。在此流动相基础上，笔者对流动相的比例进行逐步摸索，最终确定采用乙腈-甲醇(1：1)与0.3%冰醋酸溶液为流动相，按照文中“2.1”色谱条件项下流动相比例进行梯度洗脱，实现对灵龙感冒胶囊中9种成分龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素的定量测定。

3.3提取条件的选择 制备供试品时作者为考察不同提取溶剂对所测成分龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇和异欧前胡素提取率的影响，对比考察了甲醇[6-12，16-18]、50%甲醇、无水乙醇、50%乙醇等提取溶剂，结果表明，在同一提取方式相同提取时间条件下，以甲醇为提取溶剂时龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素的提取效果最佳，故以甲醇为提取溶剂；在此实验结果的基础上，笔者分别考察超声和加热回流两种提取方式对所测成分龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇和异欧前胡素提取率的影响，结果表明，超声提取和加热回流提取所测各成分综合提取率差异不大，可能与灵龙感冒胶囊的制备工艺有关，考虑实验操作的便捷和实验结果的准确度，选用超声提取方式作为灵龙感冒胶囊供试品溶液制备方式；同时又对不同提取时间进行考察研究，最终确定采用甲醇超声提取30 min作为灵龙感冒胶囊供试品溶液的制备方法。

3.4待测成分暂定含量的确定根据 3个批次灵龙感冒胶囊中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素平均含量的80%，暂定本品每克含龙胆、秦艽以龙胆苦苷计不得低于42.0 mg、以马钱苷酸计不得低于3.4 mg、以獐牙菜苦苷计不得低于5.4 mg、以獐牙菜苷计不得低于1.5 mg；含防己以粉防己碱计不得低于10.1 mg、以防己诺林碱计不得低于4.3 mg；含羌活以紫花前胡苷计不得低于10.8 mg、以羌活醇计不得低于2.7 mg、以异欧前胡素计不得低于21.4 mg。

本实验建立一种HPLC梯度洗脱法同时测定灵龙感冒胶囊中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己碱、防己诺林碱、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素的含量，所建立的方法简便，准确，重复性好，可作为灵龙感冒胶囊的有效质量控制方法。