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儿童肥胖与肥胖基因单核苷酸多态性的关系研究

2020-10-09郑毅贺琪李玉波

中国医药导报 2020年23期
关键词:肥胖测序儿童

郑毅 贺琪 李玉波

[摘要] 目的 研究肥胖基因在中国中部地区儿童中的突变情况,探究儿童肥胖与肥胖基因单核苷酸多态性(SNP)的关系。方法 选取2017年5月—2018年5月湖北省中医院肥胖科和内科就诊的5~10岁儿童100名为研究对象,依据体重指数将其分为对照组(24例)、超重组(42例)、肥胖组(34例)。所有标本均采取静脉血,采用改良的多重高温连接酶检测反应技术(iMLDR)检测肥胖基因上的三个SNP位点(rs9939609、rs1421085、rs8057044),测序技术检测三组SNP位点的突变情况。 结果 三组rs9939609、rs1421085基因型分布比较,差异无统计学意义(P > 0.05);三组rs8057044基因型分布比较,差异有统计学意义(P < 0.05);超重组和肥胖组rs8057044位点等位基因表达频率比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 5~10岁儿童中,rs8075044位点可作为潜在的成人肥胖检测位点。

[关键词] 肥胖;儿童;单核苷酸多态性位点;测序

[中图分类号] R723.14          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210(2020)08(b)-0008-05

[Abstract] Objective To study the mutation of obesity gene in children in Central China, and to explore the relationship between obesity and single nucleotide polymorphism (SNP) of obesity gene in children. Methods From May 2017 to May 2018, a total of 100 children aged five to ten were selected from the Department of Obesity and Internal Medicine of Hubei Hospital of Traditional Chinese Medicine. According to body mass index, they were divided into control group (24 cases), overweight group (42 cases) and obesity group (34 cases). Three SNP loci of obesity gene (rs9939609, rs1421085, rs8057044) were detected by the improved multiple high temperature ligase assay (iMLDR) and the mutations of SNP locus in three groups were detected by sequencing. Results There were no significant differences in genotype distribution of rs9939609 and rs1421085 loci among three groups (P > 0.05). Genotype distribution of RS8057044 locus were compared among three groups, and the differences were statistically significant (P < 0.05). There was no significant difference in allele frequency of rs8057044 locus between overweight group and obesity group (P > 0.05). Conclusion Among the children aged five to ten, rs8075044 locus can be used as a potential detection site for adult obesity.

[Key words] Obesity; Children; Single nucleotide polymorphism loci; Sequence

肥胖是一种多基因、多环境影响的复杂疾病,吸烟、药物、生活方式、基因等均能成为肥胖的原因。随着现代分子生物学技术的发展,人们对肥胖症遗传发病机制的认识更为透彻,已陆续发现FTO、MC4R等多种基因与肥胖症相关[1-2]。婴儿、儿童和青少年肥胖的流行率在全球范围内普遍上升。与高收入国家比较,低收入和发展中国家有更多的超重和肥胖儿童[3]。成人的脂肪堆积和心血管疾病发生与FTO基因上的SNP位点突变密切相关[4-5];有研究提出青少年时期的关键基因突變导致了成年期的肥胖,如0~6个月婴儿期、6岁左右幼儿期等。目前,国内外针对FTO基因上的位点突变研究较多,但结果缺乏一致性,且大多为国外报道[5-6]。本研究目的是找到我国中部地区儿童FTO基因的突变位点规律,探索儿童肥胖与FTO基因单核苷酸多态性(SNP)的关系,为儿童肥胖的遗传易感性以及及时治疗提供帮助和理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月—2018年5月湖北省中医院肥胖科和内科就诊的5~10岁儿童100名为研究对象。根据2017年《中国儿童肥胖报告》标准[7],依据BMI将其分为对照组(体重正常)24例、超重组42例、肥胖组34例。三组均为中部地区汉族儿童,排除有心脏病、脑病及其他原发性疾病及有血缘关系的儿童。

1.2 方法

1.2.1三组基本资料的测量  严格按照人体测量标准对三组儿童的身高体重和脂肪含量(FM)进行测量。身高体重用标准身高体重测量仪(郑州上禾科技有限公司,SH-201)测量[8]。脂肪含量测量仪(Hologic Corporation,Waltham,MA,USA)测量精密度为1.4%,身高体重测量仪的测量精密度为0.5%。

1.2.2 DNA提取  采集三组儿童1~1.5 mL静脉血,其中1 mL全血用于提取外周血单核细胞,DNA回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司,DP219)提取DNA,并经琼脂糖凝胶电泳(莱普特科学仪器有限公司,HS120)检测,紫外分光光度仪(赛默飞世尔科技有限公司,Orion AqualMate 8000)测量吸光度(OD)260/280的比值。经检测合格的DNA模板,用ddH2O进行重悬,并储存在-70℃低温冰箱内[9]。

1.2.3 改良多重高温连接酶检测反应(iMLDR)引物设计  本试验使用的扩增引物、连接引物等均由上海生工技术有限公司合成,上海天昊生物科技有限公司检测突变位点。本研究前期研究中针对成人所设计的引物信息见表1[10]。

1.2.4 聚合酶链式反应(PCR)扩增、光敏电阻(LDR)连接反应  经优化后的单重荧光定量PCR(美国ABI,ABI7500)体系为5 mol/L MgCl2,0.45 mol/L脱氧核糖核苷三磷酸,0.7 U Taq酶,0.30 μmol/L上游引物,0.30 μmol/L下游引物和7 μL DNA模板,加ddH2O至50 μL。优化后的反应条件:94℃ 3 min,94℃ 30 s,65℃ 25 s,72℃ 25 s,15个循环;94℃ 30 s,65℃ 30 s,72℃ 50 s,35个循环;72℃ 3 min。

扩增后的产物经凝胶回收纯化后,再进行iMLDR的连接反应。经优化后反应体系为:PCR产物5 μL,高温连接酶、5′引物混合液、3′引物混合液各1 μL、buffer 2 μL,加入无菌水至20 μL。

1.2.5 基因型的检测  5 μL产物与10 μL甲酰胺、5 μL内标液充分混匀后,经94℃变性3 min,测序仪(美国ABI,ABI3500)进行毛细管电泳测序。数据经A Plasmid Editor 2.0软件处理后,在Genebank的Blast页面进行比对,直接判读其突变类型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本t检验;计数资料用百分率表示,组间比较采用χ2检验。Hardy-Weinberg平衡吻合度分析采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较

三组年龄、身高比较,差异无统计学意义(P > 0.05),三组性别、体重、体重指数(BMI)、FM、体脂百分比(PBF)比较,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。见表2。

2.2 Hardy-Weinberg平衡吻合度检验

三组基因型分布频率符合随机性原则,可认为本研究的对象具有人群代表性[11]。

2.2.1 rs9939609位点Hardy-Weinberg平衡吻合度检验  三组rs9939609位点的等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。见表3。

2.2.2 rs1421085位点Hardy-Weinberg平衡吻合度检验  三组rs1421085位点的等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。见表4。

2.2.3 rs8057044位点Hardy-Weinberg平衡吻合度检验  三组rs8057044位点的等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。见表5。

2.3 三组基因型分布比较

2.3.1 三组rs9939609位点基因型分布比较  三组rs9939609位点纯和野生型、杂合突变型、纯和突变型比较,差異无统计学意义(P > 0.05)。见表6。

2.3.2 三组rs1421085位点基因型分布比较  三组rs1421085位点纯和野生型、杂合突变型、纯和突变型比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表7。

2.3.3 三组rs8057044位点基因型分布比较  三组rs8057044位点纯和野生型、杂合突变型、纯和突变型比较,差异有统计统计学意义(P < 0.05)。见表8。

2.4 超重组和肥胖组rs8057044位点等位基因表达频率比较

超重组和肥胖组rs8057044位点等位基因表达频率比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表9。

3 讨论

本研究通过现代分子生物学方法分析FTO基因上的3个位点(rs9939609、rs1421085、rs8057044)与儿童肥胖的关系[12-15]。结果显示,三组rs9939609、rs1421085位点基因型分布及等位基因频率比较,差异无统计学意义(P > 0.05);rs8057044位点基因型分布及等位基因频率比较,差异有统计学意义(P < 0.05),但超重组和肥胖组rs8057044位点等位基因表达频率比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。本研究结果发现,三组男童的比例高于女童,这与Almeida等[15]研究结果基本一致,在收集病例的过程中,发现超重组和肥胖组的男童或多或少的存在饮食方面的问题,如嗜饮碳酸饮料、嗜睡等,这可能也是导致其肥胖的另一原因。研究显示[16-17],男童更容易表现出进餐速度快、对内部饱食反应不足、对外部食物反应水平和对食物喜好程度增高等饮食行为特征,提示家长和学校相关机构应更注重学龄男童的饮食习惯培养。

本研究结果显示,rs9939609、rs1421085位点在肥胖和健康儿童中分布基本一致,这与其他研究结果基本相同[15-16]。国外研究显示[19],在5岁半的儿童体内,FTO基因rs9939609的A基因携带者腰围、腰臀比和BMI指数较高,本研究也发现了类似的结果,在青少年时期较早的開始进行脂肪堆积与成年后的代谢紊乱性疾病、心血管疾病密切相关。一方面,说明rs9939609、rs1421085的SNP位点不推荐作为我国中部儿童的肥胖检测位点;另一方面,本研究发现rs8057044位点在肥胖组、超重组的突变频率明显高于对照组,即rs8057044的多态性与青少年肥胖有关。前期研究发现成人rs8057044位点也存在差异,与其他针对哈萨克族的研究结果不同[20]。这可能是由于种族和地域的差异导致的。同时也说明rs8057044位点极可能从青少年时期即开始突变从而导致成人时期的肥胖,其可作为检测成人潜在性肥胖的检验位点,但需要更多的临床标本和研究加以验证。

本研究采用BMI,有研究采用腰围、腰臀比、腰围身高比等指数[21]。BMI的优势在于操作简单,计算方便,但腰围更能反映腹型肥胖,同时也是糖尿病和心血管疾病发生发展的危险因素,腰臀比能准确地反映脂肪的分布,这些指标在评价心血管疾病方面均优于BMI。此外有研究显示[21-22],腰围身高比是反映FTO基因遗传易感性的最佳指标。随着生活水平和经济的发展,肥胖特别是儿童肥胖的发生呈逐年递增的趋势。但总的来说在我国儿童中的FTO基因多态性的研究并不多,样本量也偏少,结论不尽相同[22-23]。因此,尽快找到我国儿童肥胖基因上的SNP位点突变显得尤为关键。

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