斑叶兰的组织培养及快速繁殖技术研究

2020-10-09付志惠

湖北农业科学 2020年15期

摘要：应用组织培养及快速繁殖技术对斑叶兰（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）芽的诱导和丛生芽的增殖复壮进行研究。研究发现，随着6-BA浓度的提高，斑叶兰芽增殖率上升，以6-BA 4.0 mg/L处理的增殖率最高;添加6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L可将斑叶兰增殖控制在丛生芽阶段;添加100.0 g/L椰汁和0.5 g/L活性炭有利于提高斑叶兰增殖率与丛生芽的生长势，降低褐化;添加IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭 0.5 g/L的1/2 MS基本培养基有助于斑叶兰生根且根系生长健壮。

关键词：斑叶兰（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）;组织培养;增殖;生根

中图分类号：Q943.1;S682.31 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）15-0155-04

Abstract： Rapid multiplication and tissure culture were used to study the induction of buds and the proliferation and rejuvenation of cluster buds of Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.. The results showed that with the increase of 6-BA concentration， the shoot proliferation rate increased， and a maximum of proliferation was obtained at 4.0 mg/L 6-BA， and multiplication of shoots could be achieved and controlled by combination of 6-BA 4.0 mg/L and NAA 0.2 mg/L. The rate of muhiplieation and growth could be improved in media supplemented 100.0 g/L coconut juice（CJ） and 0.5 g/L activated charcoal（AC）. Rooting of shoots were developed in 1/2 MS media with 0.5 mg/L IBA， 0.5 mg/L NAA and 0.5 g/LAC.

Key words： Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.; tissue culture; multiplication; rooting

斑葉兰（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）又名小叶青、银线莲，兰科斑叶兰属（Goodyera），多年生草本植物，高20 cm左右，生于海拔500～2 800 m的山坡或沟谷常绿阔叶林下，喜阴蔽湿润环境[1]。斑叶兰具有较高的药用价值，以全草入药，性寒，味淡;清肺止咳，解毒消肿，活血止痛，软坚散结;在临床用于治疗肺结核、咳嗽、支气管炎、毒蛇咬伤、痈疖疮疡、鼻疖等疾病[2]。另外，斑叶兰叶片十分精美，有宝石兰之称，可小盆栽植放于案上，或做假山、园林的点缀陪衬植物[3]。斑叶兰植物用途广泛，药效显著，药农大肆采掘，使之处于濒危境地。斑叶兰的繁殖一般采用分株法，在自然条件下其繁殖系数极低，一般年繁殖系数在2左右，远远不能满足市场需求。国内外对斑叶兰的组织培养报道较少[4-8]，均处于试验阶段。利用组织培养技术快速繁殖斑叶兰，并运用无土栽培等农业新技术，使野生斑叶兰变家种，有效保护野生资源，解决中药材来源匮乏的问题，满足人们用药需要，对发展中国中医药事业具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料斑叶兰为野生驯化种，取自湖北鹤峰木林子自然保护区。

以Monnier、1/2MS、White[9]为基本培养基，生长调节剂选用细胞分裂素6-BA（6 -benzylaminopurine）、激动素KT（6-Furfurylamino-purine）、吲哚-3-乙酸IAA（indole-3-acetic acid）、3-吲哚丁酸IBA（3-indolebutyric acid）、萘乙酸NAA（1-naphthlcetic acid），添加物蔗糖、香蕉泥（BJ）、椰子汁（CJ）、活性炭（AC）均为市售，琼脂购自海南省琼海市长青琼脂厂，pH为5.8。

1.2 试验方法

取当年生5～6 cm斑叶兰幼苗，流水冲洗1 h，剥去上部叶片，洗净，切成1～2 cm长的茎段，用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8 min，用无菌水冲洗4～5次，将消毒好的茎段接入配制好的培养基中，培养温度28 ℃，每日光照12 h，光照度2 000 lx，每30 d继代1次[6]。比较基本培养基、附加有机成份、不同植物生长调节剂及其配比对斑叶兰丛生芽的诱导、增殖和植株生根率的影响。其中，基本培养基分别为Monnier、1/2MS和White[9]，在3种基本培养基中均添加1.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA、30.0 g/L蔗糖、6.5 g/L（pH 5.8）琼脂;增殖诱导培养基为1/2 MS培养基，分别附加不同浓度植物生长调节剂、香蕉汁（BJ）、椰汁（CJ）和活性炭（AC）等处理。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对斑叶兰芽诱导的影响

将相同数量的斑叶兰茎段分别接种在不同的基本培养基上，观察不同时间点的褐化数及出芽数，结果表明，离体幼芽在不同培养基中的生长发育情况存在很大差异，其中1/2MS基本培养基对幼芽的诱导最好。由表1可见，在Monnier培养基中培养 15 d，40%幼芽褐化死亡，培养30 d，90%幼芽褐化死亡，10%幼芽萌发1～2个侧芽;在White培养基中培养15 d，50%的幼芽褐化死亡，培养30 d，幼芽全部褐化死亡，出芽率为0;在1/2MS培养基中培养15 d，15%的幼芽褐化死亡，25%的幼芽萌发侧芽，培养30 d时，50%的幼芽萌发侧芽，其余幼芽基本不生长。

2.2 不同浓度植物生长调节剂对斑叶兰芽增殖的影响

将相同数量的斑叶兰幼芽分别接种在不同浓度植物生长调节剂的1/2 MS+0.5 g/L活性炭基本培养基上，观察其对斑叶兰芽增殖及生长状况的影响。结果表明，在添加不同浓度的6-BA、KT和NAA、IAA的培养基中培养20 d均能生成丛生芽，且随着培养时间的延长丛生芽不断增殖，但增殖率和丛生芽生长状况有显著差异。由表2可见，8个处理中，保持NAA浓度为0.2 mg/L，调整6-BA和KT的浓度，当6-BA浓度为4.0 mg/L时，斑叶兰增殖率最高，培养20 d增殖率达370%，30 d即达445%，丛生芽生长较粗壮，颜色呈浓绿色;当KT浓度为4.0 mg/L时，培养30d增殖率达220%，但丛生芽较细弱，颜色黄绿，不如添加6-BA的效果好。而在保持IAA浓度为0.2 mg/L的基础上添加不同浓度的6-BA和KT时，同样是6-BA对斑叶兰丛生芽增殖及生长势影响较好。

2.3 培养基中添加香蕉汁和椰汁对斑叶兰丛生芽增殖的影响

将相同数量的斑叶兰丛生芽分别接种在添加活性炭（AC）、香蕉汁（BJ）和椰汁（CJ）的1/2MS增殖培养基上[10]，观察其对斑叶兰增殖及生长势的影响。由表3可知，在只添加植物生长调节剂而不加有机添加物的1/2MS培养基上，继代5次后斑叶兰丛生芽逐渐发黄且细弱，甚至部分斑叶兰丛生芽逐渐发黑坏死，并且培养基变红，褐化现象严重;在培养基中添加0.5 g/L活性炭（AC），培养30 d后可以适当改善丛生芽细弱的状况及降低褐化现象，但斑叶兰增殖率有所下降，缘于活性炭有吸附作用，在吸附酚类物质的同时也吸附了部分植物生长调节剂;在培养基中添加100.0 g/L 椰汁（CJ），斑叶兰丛生芽逐渐转绿且增殖率提高，达450%，但培养基仍然变红;而当在培养基中同时添加100.0 g/L椰汁（CJ）和0.5 g/L活性炭（AC）时，苗色恢复正常且逐渐复壮，丛生芽增殖率达470%，培养基不再发红，褐化现象得到解决，添加香蕉汁的效果不如椰汁。

2.4 不同培养基对斑叶兰试管苗生根的影响

将2 cm左右生长粗壮的斑叶兰丛生芽分切成单株接种到添加不同浓度NAA、IBA、活性炭配比的1/2 MS+椰汁100.0 g/L基本培养基上，培养30 d后，斑叶兰试管苗生根结果见表4。由表4可知，单株苗在生根培养基上培养15 d后开始生根，同时植株也在长高，培养30 d后可长成完整植株。结果表明，单株苗在添加NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培养基上斑叶兰试管苗生根率最高，且每株苗上的生根数量最多，根也比较粗壮，易移栽成活。在添加NAA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培养基上，斑叶兰试管苗生根情况与生长状况无显著差异，而在仅添加IBA 0.5 mg/L的培养基上斑叶兰试管苗生根率只有50%，并且根细弱。

2.5 生根苗的移栽技术

生根苗的移栽需要选择通气性好、保湿性好的栽培基质，可选细砂∶腐叶土∶珍珠岩=1∶1∶1作为栽培基质。在移栽时，将已生根的组培苗移出培养室置于遮阳网下揭盖炼苗，使其适应外界环境，2 d后将小苗取出，洗净根部琼脂，水苔需进行消毒，小苗移栽后，浇透水，盖膜及遮阳网保湿1周，后3 d每天将膜揭开一半通风1 h，移栽成活率达90%以上[11]。15～30 ℃是斑叶兰生长的适宜温度，夏季高温要加盖遮阳网，35 ℃以上会生长不良，可用湿帘风机进行降温，冬季5 ℃以下的低温会影响植株正常越冬，因此，在冬季温度低于5 ℃的地区栽植斑叶兰必须采取加温和保温措施。

3 小结与讨论

通过组织培养建立无菌繁殖体系是兰科植物快速繁殖常用的方法，但前人对斑叶兰属植物的组织培养技术研究较少，均处于试验阶段，肖波等[5]的大花斑叶兰种子无菌萌发研究主要利用种子萌发建立无菌性，本研究更测重于对斑叶兰工厂化快速繁殖技术的研究。选取斑叶兰茎段作为外植体进行诱导能保证母株性状，研究了3种不同基本培养基对斑叶兰芽诱导的褐化情况及诱导率，在1/2 MS基本培养基中培养30 d斑叶兰芽诱导率可达50%，褐化率也最低。在1/2 MS基本培养基中添加浓度为4.0 mg/L的6-BA与0.2 mg/L的NAA既能取得最佳增殖效果，也能使小苗生长最健壮，叶色最正常。运用KT会导致苗基部产生无效愈伤，从而降低增殖率。

在斑叶兰芽增殖继代多次后，对出现的丛生芽细弱问题进行研究，发现继代次数超过5次后丛生芽变细弱，需要在增殖培养基中增加100.0 g/L椰汁以促使幼芽复壮，有利于改善工厂化大量繁殖时苗细弱导致移植室外成活率低的问题。活性炭对于改善斑叶兰离体培养褐化有效果，以 0.5 g/L的浓度为佳。

单株苗在添加NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L的1/2MS基本培养基上斑叶兰生根率最高，且每株苗上生的根数量最多，根也比较粗壮，易移载成活，这与高丽等[8]的高斑叶兰生根试验结果相似。试管苗炼苗移栽是解决斑叶兰从异养到自养过程的关键技术，操作要规范且仔细，出瓶进入基质前必须洗净苗基部的残余培养基，以防烂苗，炼苗过程中要注意保湿、保温和适当光照。

利用离体快繁珍稀濒危植物，解决了斑叶兰自然繁殖率低、市场供不应求的局面，降低了用药成本，同时也保护了野生资源，具有良好的经济效益和社会效益。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志：第17卷[M]. 北京：科学出版社，1999.

[2] 冉先德. 中華药海：下册[M]. 哈尔滨：哈尔滨出版社，1993.

[3] 陈心启，吉占和. 中国兰花全书[M]. 北京：中国林业出版社，1998.

[4] 林国卫，陈芳丽，王钦，等. 珍稀药用植物斑叶兰（Goodyera schlechtendaliana）的研究进展[J]. 分子植物育种，2019，17（23）：7935-7941.

[5] 肖波，胡开治，易思荣，等. 大花斑叶兰种子无菌萌发及快繁技术研究[J] . 武汉植物学研究，2010， 28（5）：639-643.

[6] 付志惠，李洪林，张建霞，等. 斑叶兰的组织培养[J] . 植物生理学通讯，2006， 42（3）：480.

[7] 王爱斌，许悦，涂敏，等. 五府山斑叶兰（Goodyera schlechtendaliana）的组织培养[J]. 分子植物育种，2019，17（17）：5748-5753.

[8] 高丽，李洪林，杨波. 高斑叶兰的组织培养[J]. 植物生理学通讯，2007，43（3）：505.

[9] 谭文澄，戴策刚. 观赏植物组织培养技术[M]. 北京：中国林业出版社，1991.

[10] 付志惠. 大花蕙兰快速繁殖技术的研究[J]. 广东农业科学，2010，37（3）：125-127.