Tim-3/Galectin-9通路、Foxp3在口腔扁平苔藓患者外周血单个核细胞中的表达及意义

王冬平　罗亮　刘莉　王珣　蔡扬

[摘要] 目的 探討Foxp3与T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3（Tim-3）、半乳糖凝集素-9（Gal-9）的相关性及Tim-3/Gal-9通路在口腔扁平苔藓（OLP）发病机制中的意义。 方法 选择2015年9月—2016年9月贵州医科大学附属医院口腔黏膜病专科门诊收治的OLP患者58例为OLP组（非糜烂型36例，充血糜烂型22例），选择贵州医科大学附属医院同期收治的17名健康人为正常组。采用实时荧光定量PCR技术检测两组Tim-3、Gal-9、Foxp3 mRNA在外周血单个核细胞中的表达水平，并分析三种因子相关性。 结果 Tim-3 mRNA和Foxp3 mRNA的相对表达量在非糜烂型及充血糜烂型OLP患者中均比正常组高（P < 0.05）;Gal-9 mRNA的相对表达量在各型OLP中与正常组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）;Foxp3与Tim-3、Gal-9均呈正相关（r = 0.738，P = 0.000;r = 0.443，P = 0.010）;Tim-3与Gal-9呈正相关（r = 0.453，P = 0.018）。 结论 Tim-3/Gal-9信号通路介导的Th1细胞凋亡可能是OLP诱导Th2免疫偏移的机制之一，可能参与了OLP细胞免疫调节。

[关键词] 口腔扁平苔藓;T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3;半乳糖凝集素-9;Foxp3;实时荧光定量PCR

[中图分类号] R781.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（c）-0004-04

The expression and significance of Tim-3/Galectin-9 pathway and Foxp3 in the peripheral blood mononuclear cells of oral lichen planus patients

WANG Dongping1   LUO Liang2   LIU Li3   WANG Xun2   CAI Yang2

1.Department of Stomatology， Dalian Friendship Hospital， Liaoning Province， Dalian   116011， China; 2.Department of Periodontal Mucosa， Stomatological Hospital of Guizhou Medical University， Guizhou Province， Guiyang   550004， China; 3.Department of Oral Medicine， Guizhou Provincial People′s Hospital， Guizhou Province， Guiyang   550002， China

[Abstract] Objective To study the correlation between Foxp3 and T cell immunoglobulin domain mucin domain protein-3 （Tim-3） and Galactosin -9 （Gal-9） in order to discover the role of Tim-3/Gal-9 pathway in the pathogenesis of oral lichen planus （OLP）. Methods From September 2015 to September 2016， 58 OLP patients admitted to the specialized Outpatient Department of Oral Mucosal Disease of the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University were selected as the OLP group （36 cases of non-erosive type and 22 cases of hyperemia type）. And 17 healthy subjects admitted to the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University during the same period were selected as the normal group. The expression levels of Tim-3， Gal-9 and Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of the two groups were measured by real-time quantitative polymerase chain reaction， and the correlation of the three factors was analyzed. Results The relative expression levels of Tim-3 mRNA and Foxp3 mRNA in non-erosive OLP and hyperemic OLP were higher than those in the normal group （P < 0.05）. The relative expression levels of Gal-9 mRNA in all OLP types were not significantly different from those in the normal group （P > 0.05）. Foxp3 was positively correlated with Tim-3 and Gal-9 （r = 0.738， P = 0.000; r = 0.443， P = 0.010）; there was a positive correlation between Tim-3 and Gal-9 （r = 0.453， P = 0.018）. Conclusion Tim-3/Gal-9 signaling mediated Th1 cell apoptosis may be one of the mechanisms by which OLP induces Th2 immune migration， and may be involved in the immune regulation of OLP cells.

[Key words] Oral lichen planus; T cell immunoglobulin domain mucin domain protein-3; Galectin-9; Foxp3; Real time polymerase chain reaction

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜病中常见的慢性炎症性疾病，其发病机制尚不明确。目前，研究认为OLP是T细胞介导的自身免疫性疾病[1]，其中CD4+T淋巴细胞中的辅助性T细胞（T helper cell，Th）1和Th2两个亚群之间的失衡可能参与了OLP的发病[2]。也有研究[3]表明，调节性T细胞可能通过导致扁平苔藓患者免疫功能紊乱参与了扁平苔藓的发生。T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域基因（T cell immunoglobin domain and mucin domain protein，Tim）家族因其特殊的结构和表达特性，成为Th1/Th2细胞特异性的表面标志之一，参与了T细胞分化和免疫应答的调节。本研究通过检测贵州医科大学附属医院收治的58例OLP患者Tim-3、半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）、Foxp3 mRNA在外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的表达水平，分析Foxp3与Tim-3、Gal-9表达的相关性，探讨Tim-3/Gal-9通路在OLP免疫发病机制中的作用及意义，为临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

Gene Quant100核酸蛋白分析仪;美国Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪;淋巴细胞分离液、Trizol试剂、逆转录试剂盒（047A）、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。上海生工生物工程有限公司设计并合成引物。

1.2 研究对象

选择2015年9月—2016年9月贵州医科大学附属医院口腔黏膜病专科门诊收治的OLP患者58例作为研究对象，设为OLP组，其中非糜烂型36例，男15例，女21例;年龄29～72岁，平均（46.0±14.9）岁。充血糜烂型22例，男11例，女11例;年龄12～76岁，平均（48.0±18.1）岁。同时选择于贵州医科大学附属医院同期体检中心体检的17名健康人员作为正常组，男8名，女9名;年龄18～78岁，平均（46.5±17.8）岁。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.3 纳入及排除标准

纳入标准：①局部或全身均未使用过调节免疫、抗生素等相关制剂;②经病理确诊;③知情同意并签署知情同意书。排除标准：①经期或孕期妇女;②口腔检查有炎症及患有其他口腔黏膜病或肿瘤等;③伴皮肤损伤;④合并系统性疾病。本研究已通过医院医学伦理委员会的审核批准。

1.4 方法

抽取两组空腹静脉血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。采用淋巴细胞分离液经Ficoll密度梯度离心法分离PMBCs，Trizol试剂提取总RNA，通过紫外分光光度计检测分离的总RNA的吸光度值（OD）为1.8～2.0，分别测量各标本的总RNA浓度并计算所需RNA体积。采用Rt-PCR逆转录试剂盒获取cDNA，采用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒，按操作说明检测Foxp3、Tim-3、Gal-9 mRNA相对表达量。PCR反应条件：预变性95℃，30 s;变性95℃，5 s;退火及延伸6℃，30 s，进行40个循环。采用2-△Ct法分析各目标基因的相对表达定量，△Ct = Ct（目的基因）-Ct（内参基因），OLP组较正常组增高或降低的倍数=2-△Ct（OLP组25%～75%均值）/2-△Ct（正常组25%～75%均值）。引物序列见表1。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析。计量资料为非正态分布资料用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，各组间比较采用Kruskal-Wallace检验，组间两两比较采用Mann-Whitney U检验。相关性用Spearman分析。计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Tim-3、Gal-9、Foxp3 mRNA的表达水平

OLP组患者Tim-3 mRNA的相对表达量高于正常组，差异有统计学意义（Z = 3.303，P = 0.001），上调倍数约为2024倍。OLP组患者中，非糜烂型OLP患者Tim-3 mRNA的相对表达量较正常组升高，差异有统计学意义（Z = 3.201，P = 0.001），上调倍数约为2594倍;OLP组中，充血糜烂型患者中Tim-3 mRNA的相对表达量较正常组升高，差异有统计学意义（Z = 2.634，P = 0.008），上调倍数约为1090倍。OLP患者外周血中Gal-9 mRNA的相对表达量较正常组增高，但差异无统计学意义（P > 0.05）。OLP组Foxp3 mRNA的相对表达量高于正常组，差异有统计学意义（Z = 3.252，P = 0.001），上调倍数约为34倍。OLP组患者中，非糜烂型Foxp3 mRNA的相对表达量较正常组升高，差异有统计学意义（Z = 3.301，P = 0.001），上调倍数约为46倍;充血糜烂型OLP患者Foxp3 mRNA的相对表达量高于正常组，差异有统计学意义（Z = 2.455，P = 0.014），上調倍数约为20倍。见表2。

2.2 OLP患者外周血中Tim-3、Gal-9、Foxp3相关性分析

相关性分析结果显示：OLP患者外周血中Foxp3的表达与Tim-3、Gal-9均呈正相关（r = 0.738，P = 0.000;r = 0.443，P = 0.010）;Tim-3与Gal-9呈正相关（r = 0.453，P = 0.018）。

3 討论

OLP是口腔黏膜病中一种常见的慢性炎症性疾病，目前关于其病因和发病机制尚无定论，但其病理表现具有典型的慢性炎症特征，并且可引起相关免疫学分子标志物的改变[4]。Th1/Th2的失衡表达与OLP发病机制密切相关。本课题组前期研究结果提示：OLP患者外周血中Th1型细胞因子的表达水平无明显改变，Th2型细胞因子显著升高，呈现Th2占优势的免疫应答。由此可以推测，Th1/Th2平衡向Th2漂移可能抑制了宿主细胞的免疫应答，从而导致OLP的慢性炎症[5]。

Tim-3作为一种负性免疫调节分子，是免疫球蛋白和黏蛋白结构域家族细胞的表面分子，其广泛参与过敏、哮喘、自身免疫性疾病及肿瘤等疾病的免疫调节过程[6]。Khademi等[7]研究发现，Tim蛋白可能涉及Thl和Th2细胞介导的疾病。

Tim-3基因是第一个被发现参与T细胞免疫应答的Tim基因家族成员，是Tim家族激活诱导的抑制性受体，主要表达在分化成熟的Th1细胞中[8]，在免疫应答过程中发挥抑制性调节作用，从而有效调节T细胞凋亡以及免疫耐受过程[9-11]。Gal-9是Tim-3的天然配体，是半乳凝集素家族成员之一，主要表达于抗原递呈细胞、巨嗜细胞及CD4+T细胞以及Treg。Gal-9与Th1细胞上的Tim-3分子特异性结合后，对机体的免疫细胞尤其是Th1细胞的定位、分化趋势及分泌功能等产生影响，从而改变机体的正常免疫功能，从而延缓和/或促进疾病的发生、发展[12]。何泽现等[13]研究表明，外周血单核细胞上Tim-3可能通过调节IL-12产生间接调节Th1/Th2平衡。亦有研究表明[14]，在骨肉瘤患者的T细胞和单核细胞中Tim-3与Gal-9相互作用于免疫抑制反馈回路，从而抑制Th1反应。

在本研究中，OLP患者Tim-3 mRNA的表达高于正常组，Gal-9 mRNA的表达也有增高的趋势，两者表达量的增加使得二者结合力增强，Tim-3/Gal-9通路激活可以引起CD4+T细胞的失能[15]，降低细胞免疫，进而导致疾病的发生。目前，已有实验证实，Tim-3/Gal-9通路可以选择性地下调γ干扰素（IFN-γ）表达水平，明显抑制Thl型细胞介导的免疫反应[16]。由此推测，Tim-3及其配体Gal-9可能与IFN-γ相互作用，共同参与了OLP免疫病理变化。就本研究而言，可能是OLP患者外周血中大量分泌的T-bet[17]上调了Tim-3的表达，经Tim-3/Gal-9通路反馈性地抑制CD4+及CD8+T细胞，促进该类细胞死亡，CD8+T细胞缺乏抑制性T细胞，不能有效抑制细胞免疫与体液免疫的功能，免疫监视和负反馈的能力下降，从而导致机体免疫功能出现紊乱，进而导致疾病的发生。这与本课题组前期观察到的OLP患者外周血CD4+及CD8+T细胞数目与健康人相比减少是一致的[18]。还有研究表明：Gal-9/Tim-3信号的强弱对自然杀伤细胞活化和功能的发挥产生不同的影响，信号较弱时，自然杀伤细胞的杀伤功能增强;信号较强时，自然杀伤细胞的杀伤功能减弱[19]。本研究中，Tim-3的大量表达，使得这一通路信号过强，对自然杀伤细胞的功能发挥抑制作用或诱导其凋亡，从而减少自然杀伤分泌IFN-γ等细胞因子，进而导致Th1细胞数量降低，而Th2细胞数量占优势。

Treg是一种特定细胞亚群，具有免疫调节功能。研究证实，Treg通过抑制其他T细胞活化发挥其主要功能，降低机体免疫应答的程度，缩小免疫应答范围并缩短作用时间，从而有效阻止了自身抗原的炎症反应的发生，同时抑制机体自身免疫病发展，因而在抑制发生自身免疫性疾病及维持机体免疫平衡方面备受关注。本课题组前期研究结果已显示Treg细胞与OLP病损形成有关[20]。Foxp3属于Foxhead家族分叉头/翼状螺旋转录调节因子，这一里程碑的发现为Treg细胞研究打开了一扇新的“门”，是免疫生物学重要的进步。研究证实，Foxp3能够调节Treg细胞的发育及功能[21]。Tim-3可通过调节Treg细胞而参与炎症性疾病、过敏、哮喘、自身免疫性疾病等的免疫调节，并在凋亡细胞的清除及免疫自稳功能中具有重要作用[22]。本研究中OLP患者外周血中Foxp3表达增高，并与Gal-9、Tim-3的表达呈正相关。提示Treg水平的改变与机体免疫平衡紊乱有关，高表达的Foxp3是Treg发挥免疫抑制功能所必需的，既然Gal-9表达于Treg表面，因此，推测Treg可能通过Tim-3/Gal-9通路抑制T细胞增殖。在本研究中，Tim-3、Gal-9表达呈正相关（P < 0.05），Gal-9 mRNA的表达虽有增高的趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）。这可能与OLP的样本量有关，尤其是充血糜烂型OLP，在以后的研究过程中，课题组将扩大样本量进一步证实Gal-9表达情况。

综上所述，本研究结果显示，OLP偏离为Th2细胞介导的优势应答，其机制可能与Tim-3/Gal-9信号通路介导的促Th1细胞凋亡有关，从而使得Th1型细胞因子的分泌减少，Th1型免疫应答受到抑制。Tim-3 /Gal-9信号通路介导的Th1细胞凋亡可能是OLP诱导Th2免疫偏移的机制之一，深入研究Tim-3/Gal-9通路对免疫细胞生长、分化和凋亡的调节作用，探索OLP复杂的免疫病理变化，将为OLP和其他自身免疫性疾病的诊断与治疗提供新的思路。

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（收稿日期：2019-04-01）