肉鸡传染性喉气管炎的发生和诊断及其PCR诊断方法的建立

秦春芝

摘  要：传染性喉气管炎（ILT）是家禽重要的呼吸道疾病，主要危害成年鸡和产蛋鸡。但是，自2019年4月以来，在山东省多个地区发生多起商品肉鸡、地方品种肉鸡等感染该病并致病现象。临床主要表现为严重的呼吸困难、喘鸣、打喷嚏和伸颈呼吸，严重的咳出带血的分泌物，呼吸道粘膜出血和充血。经绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚，5 d后可产生典型的绒毛尿囊膜病变。参考GenBank中传染性喉气管炎病毒（ILTV）的序列，设计出一对针对其ICP4基因的特异性引物，对可疑病料和分离出的病原分别进行PCR扩增，结果扩增出目的条带，经测序证实为ILTV。特异性和敏感性试验证实，新建立的PCR可快速、准确地鉴定出病原，具有一定的临床推广应用价值，为有效防控ILT的发生奠定了基础。

关键词：传染性喉气管炎;肉鸡;病毒分离;PCR

中圖分类号：S858.31     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2020）8-0006-06

传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）是由传染性喉气管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡上呼吸道的喉头和气管的上皮细胞，同时对鼻窦、气囊和肺等组织产生影响。典型症状为呼吸困难、气喘，咳出带血分泌物;剖检可见喉部和气管粘膜肿胀、出血等，严重的病例则具有较高的致死性，死亡率可高达40%以上。除了ILT的典型症状外，ILT还可以表现为温和型，具体表现为粘液性气管炎、鼻炎、眼结膜炎、眼流泪等轻微症状[1]。传统认为该病大多数发生于成年鸡和产蛋鸡，但近来，低日龄肉鸡发生ILT的病例屡见不鲜，呈明显的上升趋势。

ILTV属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，只有一个血清型，不同ILTV毒株之间具有一定交叉保护。由于传染性喉气管炎与传染性支气管炎、低致病性禽流感和新城疫等家禽疫病在临床症状方面比较相似，单纯从临床症状很难与其他病原相鉴别。

鉴于ICP4基因是ILTV的保守基因，且与同亚科其它属成员的同源性较低[2，3]，故本文设计了一对特异性扩增ICP4基因的引物，进而建立一种简便、快速和准确诊断ILTV的PCR方法。

1  材料和方法

1.1  发病背景  2019年4月～2020年4月，山东莱芜、临沂、潍坊等地规模化鸡场陆续发生了一种以严重呼吸困难、咳血、气管粘膜出血和充血的鸡病，主要危害20～50日龄的白羽商品肉鸡和地方品种鸡，以30～35日龄居多。鸡群一旦感染，则传播较快，感染率在80%以上，死亡率在5%～30%，严重的死亡率可高达45%，治疗效果不佳，发病周期较长，可持续1月，给养鸡业带来了较大的经济损失。

1.2  病料处理  剖检具有典型症状的发病鸡或死亡鸡，取其气管粘膜或刮取粘膜血痰作为病料。病料剪碎后按1∶3的比例加入灭菌PBS溶液，同时加入青、链霉素（2000 IU/mL）-4 ℃冰箱过夜处理。然后，反复冻融3次后离心取上清，-20 ℃保存备用[4]。

1.3  主要试剂、材料和仪器  Simply P病毒DNA/RNA共提取试剂盒，购自杭州博日科技有限公司;DNA回收试剂盒购自天根生物科技有限公司;10×Taq PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTP，均购自湖南艾科瑞生物过程有限公司;DL2000bp DNA Marker，购自宝生物（北京）有限公司;PCR仪，购自Thermo Fisher公司;9～10日龄SPF鸡胚由山东省农业科学院家禽研究所提供。

1.3  SPF鸡胚接种  将无菌检验合格的上清液经绒毛尿囊膜（CAM）途径接种10日龄SPF鸡胚，每日照蛋观察，舍弃48 h内非特异性死亡鸡胚，观察至120 h，死亡胚和120 h活胚及时放置-4 ℃冰箱并保存过夜。在生物安全柜内，观察鸡胚和CAM病变[5]。待观察完，将CAM剪碎研磨，加入PBS稀释，反复冻融3次，离心取上清，置-20 ℃保存备用。

1.4  PCR诊断

1.4.1  引物设计  参考GenBank中ILTV经典株的ICP4基因序列，利用Prime preimer5.0软件设计ICP4基因的扩增引物IF和IR，引物由华大基因合成。

IF：5'-CCACCATACCCATACGAAACG-3';IR：5'-GCAGAGGACCAGCAAAGACC-3'。

1.4.2  核酸提取  按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取样品的DNA，-20 ℃保存备用。

1.4.3  条件优化  PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，待检DNA模板2 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，最后用RNA-free补足反应体系至25 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min;进入98 ℃变性10 s，共设置6个退火温度（53、54、55、56、57 ℃和58 ℃）退火30 s，72 ℃延伸40 s，共进行35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃结束反应。将PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，并在凝胶成像仪观察其条带大小和亮度，选择和优化反应条件。

1.4.4  特异性  采用优化的PCR条件进行扩增，将ICP4基因扩增产物进行胶回收后，连接于pMD19-T载体，转化DH5α大肠杆菌，PCR鉴定的阳性菌落接种LB液体培养基培养16 h，送华大基因测序。同时，利用该方法对新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡毒支原体（MG）、H9N2等禽类其它病原的DNA（cDNA）进行扩增，以验证该引物PCR反应的特异性。

1.4.5  敏感性  将提取的ILTV基因组DNA样品用NanoDropTM One/OneC超微量紫外分光光度计进行含量和纯度测定后，10倍稀释成六个梯度，分别取1 μL进行PCR扩增，反应产物进行电泳鉴定检测该方法的灵敏度。

1.5  系统发育树  对克隆的ICP4基因进行基因测序，从GenBank中选择不同时间、地域的ILTV分离株ICP4核苷酸序列，利用Lasergen 7.1和MEGA5软件，比较其核苷酸同源性，并采用邻接法（Neighbor-Joining）构建支原体的系统发育树，探讨不同ILTV之间的遗传距离和系统演化关系。

2  结果

2.1  临床病变和病原分离  临床发病鸡表现为典型的呼吸困難、气喘，咳出带血分泌物。剖检可见喉部和气管粘膜肿胀、出血（见图1），具有ILT的典型病变特征。

将病料上清接种SPF鸡胚，120 h内未出现鸡胚死亡。剖检鸡胚发现：接种胚的CAM明显增厚，接种部位出现典型的痘斑，具体表现为边缘增厚，中间凹陷，见图2;且接种鸡胚与空白对照组相比，接种组鸡胚明显发育较小，部分鸡胚胚体出血。该结果证实，分离到一株疑似ILTV毒株，并将其命名为SD20。

2.2  PCR方法的建立

2.2.1  条件优化  进行了退火温度的筛选，结果表明，PCR在53～58 ℃均能扩增，但以56 ℃效果最佳。

2.2.2  特异性检测  检测结果见图3。由图3可见，该PCR反应对新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡毒支原体（MG）、H9N2等禽类其它病原的DNA（cDNA）无反应，仅与ILTV有特异性反应。PCR产物凝胶电泳结果约为700bp，结果符合试验预期。

2.2.3  序列测定  对ILTV ICP4基因的测序测定表明，其基因长度为648bp。同源性比较显示，SD20分离株ICP4基因与传染性喉气管炎鸡胚疫

苗株（CEO）、中国ILTV经典强毒王岗株（WG）和澳大利亚CL9毒株的同源性均为100%，与美国等其它ILTV分离株的同源性也在99.1%以上;但与α疱疹病毒亚科马立克病毒属MDV（JF742597）的同源性仅为24.4%，证实SD20分离株为ILTV。

2.2.4  敏感性检测  敏感性检测结果见图4。

当样品稀释到10-3时，仍可见PCR阳性扩增，表明PCR可检测的最低核酸浓度为45.7 pg/μL。

2.3  系统发育树  系统发育树见图5。由图5可见，SD20株与ILTV CEO疫苗株、中国经典强毒WG株等处于同一分支，显示出较近的亲缘关系;与我国2013年广东ILTV流行株、2011年安徽ILTV流行株基本相同，处在同一分支，推测是同一类ILTV流行野毒;与ILTV组织培养疫苗株（TCO）、俄罗斯2009年ILTV流行株、美国2012年ILTV流行株等处于相邻的分支，具有一定的差异性。比较特殊的是，SD20株与3株澳大利亚2014～2019年ILTV分离株遗传距离较远，处在两个遗传演化关系相对较远的分支。

3  讨论

3.1  成功从商品肉鸡中分离到一株传染性喉气管炎病毒SD20株，在SPF鸡胚上产生了典型的痘斑病变，进行了序列测定  测序结果表明，SD20株ICP4基因片段长度为648bp，与ILTV疫苗株CEO、中国WG株的核苷酸同源性为100%，确证了本次发生在商品肉鸡、地方肉鸡上的疫情为ILT。至于ILTV的来源，目前尚有争论：一方面有人推测可能来源于免疫鸡群的带毒和散毒;另一方面，推测与临床大量使用鸡胚来源的ILTV疫苗有关。已有研究证实，2008年美国商品肉鸡发生的ILT可能与CEO疫苗使用有关[6]。SD20是否来源于ILTV CEO疫苗株，尚需进行大量深入细致的研究工作和评价，以求获得更多的证据。

3.2  建立了一种可靠的PCR方法，可用于ILTV的快速诊断和确诊  ICP4基因是ILTV的保守基因，与疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科本属成员同源率接近100%，而与其它亚科成员的同源性较低（不足30%），这样就明确了本实验所设计的引物特异性高，与常见的其它呼吸道病原如NDV、IBV等均不发生反应，且具有较高的敏感性，可检测到DNA最低浓度为45.7 pg/μL，适合于临床ILT的定性检测。

3.3  众多的免疫研究表明，ILT的免疫主要是细胞免疫  活疫苗是控制传染性喉气管炎最重要的手段。一般而言，3周龄以内的雏鸡对ILTV不易感，但成年鸡和产蛋鸡对ILT最易感。ILTV疫苗通常有鸡胚疫苗（CEO）、组织培养疫苗（TOC）和鸡痘重组疫苗（RFP）三种，其中TOC疫苗只能点眼，重组疫苗RFP只能肌注，只有CEO疫苗既可饮水又可点眼或肌注，各种免疫途径都适合。但是，CEO疫苗在鸡体内反复传代，具有毒力复壮的潜在威胁，已为大量文献所证实。组织培养疫苗（TOC）和鸡痘重组疫苗免疫接种相对安全，但必须点眼或肌注等人为操作，比较耗时、费力，花费大量人力、财力和物力[6]。

CEO疫苗在生产中最常用。点眼接种弱毒疫苗是控制ILTV的重要技术措施。点眼接种适用于不同日龄的鸡。一般不建议饮水免疫，会造成免疫失败或疫苗株毒力返强等[7]。该疫苗具有一定的毒力，疫苗接种后，往往会有5%～10%的鸡发生结膜炎，但一般在1周内恢复。严重的可引起死亡。不能对4周龄以下的雏鸡（对雏鸡可致病）和18周龄以上的鸡进行接种（对开产前的鸡有一定的致病性）。商品肉鸡一般不免疫。特殊情况下，如周边发生了ILT，则建议紧急疫苗免疫。一旦免疫，则至少需要连续免疫1～2年，在连续两年内无ILT发生时，则可考虑停止疫苗接种[8]。

3.4  ILT一旦發病，无特效药治疗

3.4.1  紧急接种和消毒  疫病发生后要迅速淘汰病鸡和处置鸡群，以防产生更大的损失。同时，隔离易感鸡群，必要时紧急接种，疫苗接种可显著降低发病损失并缩短发病时间。对发病和死亡的鸡必须进行严格无害化处理，防止疫病扩散。彻底清洗建筑物和设备，可采用消毒剂如酚盐、次氯酸钠、碘伏或季铵盐复合物进行喷雾消毒。

3.4.2  对症辅助治疗  对于价值较大且不能淘汰的鸡群，可应用平喘药物可缓解症状，每只鸡可用盐酸麻黄素10 mg/d或氨茶碱50 mg/d，饮水或拌料投服，连用4～5 d;0.2%氯化铵饮水，连用2～3 d。可采用地塞米松、卡那霉素和泰乐菌素等饮水，防止继发细菌感染。

参考文献：

[1]  Saif.Y.M主编，苏敬良，高福，索勋主译.禽病学（第十二版）[M].北京：中国农业出版社， 2012.

[2]  木古丽，王云峰，候绍华，等.鸡传染性喉气管炎病毒WG株ICP4基因的鉴定及其在潜伏位点的表达[J]. 中国预防兽医学报，2007，29：417-422.

[3]  王学敏，陈溥言.传染性喉气管炎病毒的基因结构及基因工程疫苗研究进展[J].中国家禽，2007，29：54-57.

[4]  李伟，刘冬冬，吴丹，等.鸡传染性喉气管炎病毒的分离和鉴定[J].中国动物保健，2019，11：55-56.

[5]  Shan-Chia Ou JJG.Infectious laryngotracheitis virus in chickens[J].World Journal of  Virology，2012，1：142-149.

[6]  Louise Dufour-Zavala.Epizootiology of Infectious Laryngotracheitis and Presentation of an Industry Control Program[J].Avian Disease，2008，52：1-7.

[7]  Groves PJ，Williamson SL，Sharpe SM， et al.Uptake and spread of infectious laryngotracheitis vaccine virus within meat chicken flocks following drinking water vaccination[J].Vaccine，2019，37：5035-5043.

[8]  李丽双.蛋鸡传染性喉气管炎的流行病学、临床表现、实验室诊断和防控[J].现代畜牧科技，2019，1：48-49.

Abstract： Infectious laryngotracheitis（ILT） is an important respiratory disease in poultry， which mainly harms adult chickens and laying hens. However，since April 2019， a number of commercial broilers and local breed broilers have been infected by infectious laryngotracheitis virus in many areas of Shandong Province，and have led to serious outbreaks.The disease is characterized by anorexia，depression，and  serve respiratory distress，with coughing，sneezing，gurgling，gasping，and rales.The trachea is often partially occluded，and bloody，mucous exudates may be expelled during violent expectorating efforts.The ILT virus（ILTV）was isolated by inoculation of chorioallantoic membrane（CAM）of 10- day-old developing of SPF chicken embryos.Lesions developed on the 5 days post-infection.Referring to and combining the sequence of infectious laryngotracheitis virus （ILTV） in the GenBank，a pair of specific primers were designed to target its ICP4 genes， and the target bands were PCR amplified for suspicious and isolated pathogens which were confirmed as ILTV by sequencing.The specificity and sensitivity experiments confirmed that the newly established PCR can identify pathogens quickly and accurately， and has certain clinical popularization and application value， which lays a foundation for effective prevention and control of ILT.

Key words： Infectious laryngotracheitis;broilers;virus isolation;PCR