阳和化岩汤对乳腺癌癌前病变细胞P53、Ki67表达的影响研究

王晓娜,刘晓菲,2*,孙颖,李斐斐,史文娴

(1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250355； 2.山东省中医经典名方协同创新中心，山东 济南 250014; 3.山东中医药大学中医学院，山东 济南 250014)

乳腺癌的发病机制十分复杂，是最常见的女性恶性肿瘤之一。据世界卫生组织统计，乳腺癌现居全球女性恶性肿瘤首位[1]。近年来，其发病率不断升高且趋于年轻化[2]。随着现代医学与传统医学的结合，中药在乳腺癌的发生和发展过程中有一定的预防和治疗作用[3]。其中，Ki67是一种与细胞增殖相关的核抗原，能够确切反映肿瘤细胞的增殖活性,与乳腺癌的发展及预后密切相关[4]。P53是目前所知的一种重要的抑癌基因，但其突变会成为癌基因。本研究主要通过免疫细胞化学法和半定量RT-PCR法检测阳和化岩汤及拆方对Ki67、P53表达的影响，为临床应用提供数据支持。

1 实验细胞及材料

1.1 实验细胞

乳腺癌癌前病变MCF-10AT细胞由上海龙华医院陈红风主任惠赠。

1.2 实验药物与试剂

DMEM/F-12培养基、胎牛血清(FBS)，Gibco公司产品;胰蛋白酶粉(Trypsin)、DMSO、MTT，Amresco公司产品;RNA酶，Sigma公司；P53、Ki67一抗，北京博奥森公司产品；即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒，均为武汉博士德生物工程有限公司;引物由上海生工生物工程公司合成;其余常规生化试剂均为国产分析纯。

实验分组细胞对照组:不加任何处理因素。

中药制备：阳和化岩汤组由鹿角霜12 g，淫羊藿9 g，白花蛇舌草12 g，山慈菇12 g，三棱9 g，莪术12 g，半夏9 g，浙贝9 g组成。制剂：加入10倍量的水在中药中，提取挥发油6 h，将收集的挥发油另器保存备用；将药液滤过浓缩至1∶1.5(药材：药液)，加入乙醇使含醇量达到60%，静置24 h后取上清液，沉淀部分离心，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为相对密度1.18(60 ℃)备用。另将挥发油与吐温-80混匀，加入上述药物提取液中，混匀，再加入蔗糖，山梨酸，调节pH值并用水调整浓度至0.84 g/mL。采用上述水提醇沉法制备各拆方组，温阳组(鹿角霜12 g，淫羊藿9 g)0.21 g/mL、解毒组(白花蛇舌草12 g，山慈菇15 g)0.27 g/mL、活血组(三棱9 g，莪术12 g)0.21 g/mL、化痰组(半夏9 g，浙贝9 g)0.18 g/mL。他莫昔芬(TAM)制备：将其溶于生理盐水，浓度为0.03 mg/mL。

1.3 实验仪器

BB16uv/BB5060uv CO2培养箱，Heraeus公司产品；Axiovert 40倒置相差显微镜,德国蔡司公司产品；Elx50型洗板机、ELx808全自动酶标仪，美国Biotek公司产品；FACSCalibur流式细胞仪，美国BD公司产品；LAS-4000型化学发光及荧光影像分析仪，日本富士公司产品；sgavplus型超纯水系统，法国Super-Q plus产品；ClassⅡ2085型超净工作台，美国Thermo Forma公司产品；DT5-3型低速自动平衡离心机，北京时代北利离心机有限公司产品；Veriti 96孔型梯度PCR仪，美国ABI公司产品；HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统。

2 实验方法

2.1 免疫细胞化学法

2.1.1 细胞分组及造模方法

将MCF-10AT细胞消化吹打制成1×105/mL细胞悬液，在6孔板中进行爬片，分为阳和化岩汤组、及拆方温阳组、化痰组、活血组、解毒组、三苯氧胺组、空白对照组共7组，研究7组P53、Ki67蛋白表达差异。分别加入30%阳和化岩汤、温阳组、化痰组、活血组、解毒组及他莫昔芬组药物，浓度分别为0.84、0.21、0.18、0.21、0.27 g/mL、0.03 mg/mL；对照组加等量生理盐水。7组共培养72 h 后按SABC 试剂盒说明书进行染色，计算出灰度值阳性表达率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2.1.2 结果判定方法

Ki67阳性细胞在细胞核表达棕黄色颗粒，P53阳性细胞在细胞核表达棕黄色颗粒。高倍镜下选择阳性细胞较多的区域采集3～5个光镜视野，输入到HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统内，在相同的背底和倍体条件下选择相应的参数，进行计算机完全定量分析。以阳性细胞所占比例的平均值定义为阳性细胞百分比，并将其作为阳性率评定依据，阳性细胞着色强度用灰度值表示，着色强度越高，灰度值越低，反之，着色强度越低，则灰度值越高。

2.2 半定量RT-PCR法

采用Trizol一步法提取细胞总RNA。取少量总RNA于紫外分光光度计下测定波长260 nm和280 nm的吸光度比值，利用寡聚体DNA260计算RNA浓度，并稀释至1 g/L。以反转录后获得的cDNA为模板，PCR扩增目的基因。

扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，52.5 ℃持续1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次，最后1 个循环后72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存产物。取6 μL 扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，采用Kodak 1D型凝胶自动成像分析系统分析凝胶电泳结果，计算目的基因mRNA的相对含量，实验重复3次。

表1 引物序列

2.3 统计方法

3 结果

3.1 免疫细胞化学法检测蛋白表达灰度值

3.1.1 免疫染色结果

空白对照组细胞质和细胞核中P53蛋白表达，呈阳性(+)；实验组细胞P53蛋白弱表达于细胞质，见图1。空白对照组细胞核中Ki67蛋白强表达，呈阳性(+)；实验组细胞Ki67蛋白弱表达于细胞核，见图1～2。

图1 免疫组化法检测P53蛋白表达情况(×400)

3.1.2 免疫细胞化学法检测P53蛋白表达阳性率

P53蛋白表达见表2，阳和化岩汤组及三苯氧胺组与空白对照组比较，P<0.05，具有统计学差异；温阳组、活血组、化痰组及解毒组与阳和化岩汤组相比，P<0.05，具有统计学差异。

表2 P53蛋白表达阳性率、Ki67蛋白表达灰度值

图2 免疫细胞化学法检测Ki67蛋白表达情况(×400)

3.1.3 免疫细胞化学法检测Ki67蛋白表达灰度值

Ki67蛋白表达灰度值见表2，阳和化岩汤组及三苯氧胺组与空白对照组比较，P<0.05，具有统计学差异；温阳组、活血组、化痰组及解毒组与阳和化岩汤组相比P<0.05，具有统计学差异。

3.2 RT-PCR检测P53、Ki67 mRNA表达

RT-PCR检测P53 mRNA相对表达见表3、图3，阳和化岩汤组及三苯氧胺组与空白对照组比较(P<0.05)，具有统计学差异；温阳组、活血组、化痰组及解毒组与阳和化岩汤组相比(P<0.05)，具有统计学差异。

表3 RT-PCR检测P53 mRNA、Ki67 mRNA相对表达量

注:1.阳和化岩汤组;2.温阳组;3.活血组;4.化痰组;5.解毒组;6.三苯氧胺组;7.空白对照组

RT-PCR检测Ki67 mRNA结果见表3、图4，阳和化岩汤组及三苯氧胺组与空白对照组比较P<0.05，具有统计学差异；温阳组、活血组、化痰组及解毒组与阳和化岩汤组相比P<0.05，具有统计学差异。

注:1.阳和化岩汤组;2.温阳组;3.活血组;4.化痰组;5.解毒组;6.三苯氧胺组;7.空白对照组

4 讨论

根据乳腺癌癌前病变的证候特点及临床表现，该病属传统医学“乳癖”范畴[5]。其病因多与情志、饮食及劳倦等因素有关，导致肝气郁结，痰瘀互结或冲任失调，阻于乳络而发，出现双侧乳房疼痛、肿块，并与月经周期有关。裴晓华认为本病“毒瘀互结”，可进展为乳腺癌[6]。因此，本病可从温肾助阳、化痰散结等方面进行辨证治疗。

目前，乳腺癌癌前病变的预防及治疗主要采用温阳法[7]。本实验采用的阳和化岩汤由清代高思敬《外科医镜》中的阳和化岩汤加减而成。方中鹿角霜、淫羊藿温补肾阳，半夏、浙贝化痰散结，三棱、莪术行气活血，山慈菇、白花蛇舌草清热解毒，全方温肾助阳与化痰散结并用，佐以行气活血、清热解毒，攻补兼施。现代药理学研究表明，鹿角霜对大鼠乳腺增生有一定的治疗作用[8]。淫羊藿苷具有抑制乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-23l等作用[9]。半夏总生物碱对乳腺癌细胞增殖有一定抑制作用[10]。浙贝母总生物碱能够抑制耐药肿瘤细胞P-糖蛋白(P-gp)的外排活性,从而降低肿瘤细胞的耐药性[11]。三棱黄酮(RSF)能够有效抑制乳腺癌MCF-7的细胞增殖[12]。李文静[13]等实验结果表明，莪术油能够抗大鼠乳腺增生，与改善大鼠紊乱的激素水平有关，殷玉琨[14]等前期实验证实，莪术油对抑制大鼠乳腺癌癌前病变进一步发展有一定治疗作用。叶兰[15]等实验研究证明，三棱与莪术抑制血管内皮细胞增殖，可能与VEGF蛋白表达显著下降有关。宋舟等实验研究表明，白花蛇舌草可降低血清中VEGF的含量[16-17]，山慈菇中的秋水仙碱、姜黄素能够抑制乳腺癌细胞生长增殖以及诱导凋亡，干扰乳腺癌细胞的侵袭及迁移及抗血管生成等作用[18]。现代研究药理学研究表明，温阳化痰法能够减缓乳腺癌细胞增殖及促进细胞凋亡来抑制癌变进程[3]。

研究表明，细胞核内蛋白Ki67抗原与乳腺癌的增殖与预后相关。Ki67是在细胞周期的活跃阶段表达的一种增殖标记[19]，在G1期和S期早期水平较低，在有丝分裂时达到峰值水平，在后期和末期，表达水平急剧下降，它在静息阶段G0期间不表达[20]。相关研究证实，Ki67在健康乳腺组织中低水平表达(<3%)[21]，Ki67的表达在从良性乳腺疾病到导管原位癌再到浸润性乳腺癌的整个过程中逐渐增加[22]。同时，Ki67与恶性肿瘤呈正相关，蛋白表达越高，癌细胞增殖活性越高，预后越差[23]。

P53是公认的抑癌基因，位于人染色体17p13。它分为野生型与突变型，野生型P53可以参与DNA的修复，抑制癌细胞增殖并促进其凋亡，与细胞周期、血管形成等多个方面有关，但不易被检测到。研究表明，乳腺癌中P53发生突变的机率约为25%～30%[24]。突变型P53比野生型P53更稳定[25]，突变的p53蛋白可以在携带突变基因的癌细胞中积累，许多肿瘤细胞核显示出p53的强染色，而周围正常组织中的细胞显示出弱的或缺失的p53免疫反应性[26]。突变型P53能够诱导细胞癌变，加快癌细胞增殖，由于突变型半衰期延长，更易被检测到[27]。

本实验通过免疫细胞化学法和半定量RT-PCR法检测阳和化岩汤及拆方对Ki67、P53表达的影响，结果显示，阳和化岩汤及拆方均能降低Ki67、突变型P53的表达。现代药理研究表明，阳和化岩汤中的单味中药对乳腺癌都有一定的抑制或治疗作用，本实验证明，三苯氧胺与阳和化岩汤可减缓肿瘤细胞增殖活性，达到延缓乳腺癌进一步发展的目的，其机制可能与降低Ki67、突变型P53的表达有关。拆方组对抑制或治疗乳腺癌有一定疗效，但温阳化痰、活血解毒的阳和化岩汤疗效更有优势，为临床治疗乳腺癌提供了更好的思路与方向。