基因多态性在磷脂酶A2受体相关性膜性肾病中的意义

张 丹 刘 爽 林芙君 边 帆 蒋更如

2009年，Beck等[1]发现特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)患者肾小球中的M型磷脂酶A2受体(M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R)是成人IMN的重要靶抗原, IMN因此被认为是一种抗足细胞抗体介导的自身免疫性肾脏病。此外，抗PLA2R抗体滴度水平与疾病免疫活动度密切相关，可反映疾病进展或缓解情况[2-3]。

虽然IMN并非遗传性疾病，但近年来随着对IMN发病机制中基因研究的不断深入，基因多态性在IMN疾病发生、发展中的重要作用逐渐受到关注。一项通过全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)的研究发现，人类白细胞抗原(HLA)-DQA1和PLA2R1基因与IMN的发生显著相关, 且两种基因的组合型同样可增加患者对IMN的易感性[4]。此后，国内外学者相继报道了不同基因位点与IMN发生的关系，但相关研究结论仍存在争议。IMN的发生、发展与PLA2R有无相关性仍待进一步明确。

本研究对PLA2R相关性IMN和非PLA2R相关性IMN患者的基因型进行比较，旨在了解本研究队列中PLA2R基因多态性与PLA2R抗原及其抗体的相关性，为今后的大样本研究提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2010年11月—2017年10月在上海交通大学医学院附属新华医院肾内科住院的128例IMN患者。纳入标准：首次入院；肾脏活组织病理学检查符合膜性肾病的诊断标准；排除乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等引起的继发性肾脏疾病；无NSAID、金制剂、青霉胺类等药物使用史；无有机溶剂和汞等化学物质接触史。记录患者的临床基础资料、随访资料和病理学资料。收集患者肾脏活组织病理学检查标本，制成石蜡切片后于常温保存。根据肾脏免疫组织化学染色结果中肾小球PLA2R沉积与否分为PLA2R相关性IMN组和非PLA2R相关性IMN组。本研究经医院伦理委员会审核批准(XHEC-D-2020-121)。

1.2 基因多态性检测

1.2.1 DNA提取 ①用移液管从EDTA抗凝管中取出500 μL患者全血样本，加入500 μL细胞裂解液，颠倒混匀5次，2 000×g室温，离心3 min, 弃上清液；再向沉淀中加入500 μL细胞裂解液，颠倒混匀5次，2 000×g，室温离心3 min，弃上清液，将离心管倒置于洁净无菌的吸水纸上停留2 min, 并确保沉淀在管中(避免沉淀被倒出，推荐使用尖底离心管)。②配置缓冲液GB与蛋白激酶K的混合液；在沉淀中加入混合液200 μL，立即涡旋混匀至溶液无团块；65 ℃放置混悬液10 min, 颠倒混匀数次。加入200 μL无水乙醇溶液，颠倒混匀至出现丝状或簇状沉淀。③将所得溶液和沉淀加入吸附柱CB3[天根生化科技北京(有限)公司]，将吸附柱放入收集管中，13 000×g室温，离心30 s，倒弃收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管。向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，13 000×g，室温离心30 s，倒弃收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管。向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液，13 000×g，室温离心30 s，倒弃收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管；重复漂洗1次后，13 000×g，室温离心2 min，倒弃收集管中废液。④将吸附柱CB3在室温放置，彻底晾干吸附材料中残余漂洗液。将吸附柱CB3转入离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200 μL Tris-EDTA(TE)洗脱缓冲液，室温放置5 min, 13 000×g，室温离心2 min, 收集上清液至离心管中。

1.2.2 DNA浓度与纯度检测 应用紫外分光光度计(美国艾本德生物公司)进行检测，选择DNA检测模式，将样本稀释10倍。以双蒸水冲洗条形槽10次。加入10 μL双蒸水，确定基线。再以双蒸水冲洗条形槽10次，加入样品检测。

1.2.3 目的基因扩增 在文献和单核苷酸多态性(SNP)数据库中检索DNA序列，应用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，碱基序列交由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列见表1。

1.2.4 PCR反应体系 ①将上述引物以TE缓冲液稀释至100 μmol/L后等量混合均匀(引物混合液1)。第1轮PCR催化反应体系为10 μL ExTaq混合物、1 μL 引物混合液1、50 ng DNA，双蒸水补充反应体系至20 μL。PCR反应条件为96 ℃预变性3 min，96 ℃变性30 s，退火1 min，72 ℃延伸5 min，15个循环，扩增结束后设置4 ℃保存。②加入20 μL AMPure磁珠 (美国贝克曼库尔特生物公司) 混匀静置5 min， 然后置于磁力架上至磁珠完全分离。弃上清液，加200 μL的80%乙醇溶液静置30 s，再弃上清液；再次加入200 μL的80%乙醇溶液静置30 s，再弃上清液。晾干后从磁力架上取下，加入混合液[ExTaq混合物10 μL、引物混合液2(正向引物序列为5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3’，反向引物序列为5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA AT 3’；NNN NNN为不同组合的碱基序列，用于区分不同样品)2 μL、双蒸水8 mL]重悬磁珠。第2轮PCR反应条件为96 ℃预变性3 min，96 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸5 min，15个循环，扩增结束后设置4 ℃保存。③加入20 μL AMPure磁珠混匀静置5 min，置于磁力架上至磁珠完全分离。弃上清液，加入200 μL的80%乙醇溶液静置30 s，再弃上清液；重复该步骤。晾干后从磁力架上取下，加入20 μL双蒸水重悬磁珠静置3 min；再置于磁力架上至磁珠完全分离，将上清液转移至新的离心管，做好标记。

表1 SNP与引物序列

1.2.5 电泳 ①制备缓冲液取5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液稀释成0.5×TBE稀释缓冲液。②制备胶液，称取1 g琼脂糖，倒入锥形瓶中，加入100 mL 0.5×TBE稀释缓冲液，微波炉加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀后置于室温冷却至50 ℃左右。向琼脂糖凝胶中加入核酸染料，充分混匀。③制备胶版，在制胶槽内放入梳子，将前一步骤中的胶液缓慢倒入制胶槽中静置，形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拔出梳子，将内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，使其没过凝胶表面。④加样，将DNA样品5 μL与上样缓冲液1 μL在加样板上混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中，中间一个加样孔中加入DNA标志物。⑤电泳，加样完毕，开始电泳。控制电压于60～80 V，电流>40 mA。当染料条带移动至距离凝胶前沿约1 cm时，停止电泳。取出凝胶，应用紫外线透射凝胶成像系统观察目的条带的分布情况，有无杂带出现。拍照、记录并保存。

1.2.6 测序PCR 扩增产物纯化后在测序仪(HiSeq X Ten，美国因美纳生物公司)上进行反应，分析各样本位于待测SNP位点处的基因型。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计学软件。计数资料以频数(n)和百分率(%)表示，组间比较采用Pearsonχ2相关分析或Fisher确切概率法。所有检验均为双侧检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本研究对筛选出的100例PLA2R阳性的IMN患者和28例PLA2R阴性患者进行相关SNP检测。候选SNP位点包括6个PLA2R1基因位点和1个HLA位点。对基因进行遗传平衡检验，位点基因型、等位基因频率均达到遗传平衡。各位点测序分型后基因型和等位基因频率见表2。同时，从HapMap数据库 (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和Exome Aggregation Consortium外显子组测序项目(ExAC Browser) (gs:∥gnomad-public/legacy)中分别查询各位点的次要等位基因频率(minor allele frequency, MAF)。

本队列IMN患者分别与以上两个基因数据库中的健康人群的MAF相比，rs4664308、rs3749117、rs3828323和rs2715928的MAF差异均有统计学意义(P=0.020、0.009、0.005、0.002、0.001)。PLA2R相关性IMN组中rs3828323等位基因频率显著高于非PLA2R相关性IMN组(P=0.020)。见表2。

PLA2R相关性IMN组和非PLA2R相关性IMN组rs3828323均以CC型为主，前组CC型比例更高，两组间的差异有统计学意义(P=0.04)。rs4664308、rs2715928和rs3749117在两组间均分别以纯和突变AA型和TT型为主，3组基因在PLA2R相关性IMN组AA型或TT型人数均多于非PLA2R相关性IMN组，但两组间的差异无统计学意义(P值均>0.05)。HLA-DQA1基因rs2187668大多为GG型，未发现AA型。两组间其他位点基因型的差异无统计学意义。见表2。

表2 PLA2R相关性IMN组与非PLA2R相关性IMN组基因型和基因频率比较

3 讨 论

自2009年Beck等证实PLA2R是IMN特异性靶抗原以来，PLA2R抗原与抗体结合的相关基因研究日益受到关注。2011年，Stanescu等[4]分别对英国、法国和荷兰的IMN患者进行全基因组多态性的分析显示，6号染色体的HLA-DQA1 (SNPrs2187668)和2号染色体的PLA2R1(SNPrs4664308)与人群IMN发病密切相关，且当2种危险基因型同时出现时，患者患病的危险度(OR值)可增至8.5，提示2种危险基因共同参与人群对IMN的易患性。随后，Lv等[5]对中国人群PLA2R1(SNPrs4664308)和HLA-DQA1(SNPrs2187668)两种危险基因型组合(AA/GA+AA)和保护基因型组合(GG/GG)进行研究后发现，前者发生IMN的风险是后者的11.3倍；说明在我国人群中HLA-DQAl和PLA2R1基因多态性与IMN的发病机制亦相关且两种基因具有协同效应。研究[5]发现，在同时携带HLA-DQAl和PLA2R1危险基因型的患者中，73%的患者血清抗PLA2R抗体呈阳性，75%的患者肾组织中肾小球表达PLA2R抗原。而含两种保护基因型的患者中血清抗PLA2R抗体、肾小球表达PLA2R抗原均呈阴性。提示抗PLA2R抗体的生成可能与PLA2R1和HLA-DQAl的基因序列改变相关。目前普遍的观点认为，一方面，PLA2R基因的改变影响了PLA2R蛋白质编码，继而改变其表位构象；另一方面，HLA基因使其产物HLA Ⅱ类分子发生结构改变；两种机制均可影响PLA2R抗原肽与抗原递呈细胞表面HLA分子的结合，从而影响抗体的产生。

本研究对PLA2R1基因和HLA-DQA1基因的SNP进行检测发现，与健康人群相比本队列IMN患者rs3828323、rs3749117、rs2715928和rs4664308的MAF差异均有统计学意义，这与以往研究结果一致，即在欧洲白人、西班牙裔、印度裔或亚裔人群中均发现上述SNP与IMN发病具有相关性[4-7]。而rs3828323、rs35771982和rs3749117基因频率在东亚地区患病与健康人群中的差异更加明显，提示基因多态性在不同种族、地域人群中存在特异性。既往研究结果也表明，亚洲人群中rs35771982与IMN发生的关系更为密切。然而，不同研究的结果存在一定差异, Kim等[8]针对韩国人群的研究发现，IMN患者中rs35771982 C等位基因频率明显增高；而中国大陆、中国台湾省和印度的相关研究[5,7,9]结果则显示，rs35771982 G等位基因频率显著增高，可能与研究样本不同种群的差异相关。

本研究还发现，PLA2R相关性IMN组和非相关性IMN组人群rs3828323均以CC型为主，前者比例更高。部分研究[7-8]同样发现，IMN患者rs3828323 CC型较对照人群比例升高。rs3828323 (Gly1106Ser)位于PLA2R1基因24号外显子，作用于CTLD6和CTLD7间的连接区域[8]。 由于其错义突变可替代重要的氨基酸继而改变PLA2R的抗原性和生物活性，影响抗原与抗体的结合，因而该基因可能与PLA2R相关性IMN的发生更为密切。Lv等[5]比较危险基因组合型(rs4664308 AA型、rs35771982 GG型和rs3749117 TT型)的IMN患者与保护基因组合型的IMN患者的研究发现，前者血清PLA2R抗体和肾组织PLA2R抗原表达均显著高于后者。而Kanigicherla等[10]的研究结果显示，抗PLA2R抗体滴度水平与PLA2R1 SNP(rs35771982、rs4664308)无显著相关性，而与HLA-DQA1、DQB1基因相关。本研究中，PLA2R相关性IMN组和非相关性IMN组rs4664308、rs35771982、rs3749117和rs3749119多以AA型、GG型、TT型和CC型为主，但两组间的差异均无统计学意义。此外，本研究发现，HLA-DQA1基因rs2187668大多为保护型(GG型)，未发现AA型。既往研究[4-5]结果显示，在欧洲白人中HLA-DQA1基因表达与IMN发生更为密切，而中国人群中HLA-DQA1危险基因型(AA)发生率则显著低于白人，且其与PLA2R1基因的协同作用也较低。近期日本的一项研究[11]显示，IMN患者多携带保护型基因，未检测出AA型。以上均提示不同种族人群基因存在差异，可能是白人IMN发病率高的原因之一。

由于本研究为单中心实验，且样本量较小，尤其是非PLA2R相关性IMN组人数较少，因此研究结果可能产生偏倚。由于种族因素与基因表达密切相关，目前不同研究结果发现的致病位点，以及关联程度并不相同，并且PLA2R抗原肽构象改变和表位暴露也可能与环境因素相关，或是环境与基因共同作用的结果。因此，现有的研究结果都需要通过更大样本量、更多不同种族人群的比对加以验证。